食管鳞癌中MMP－2 TIMP－2的表达及意义

赵红莲， 林 健， 赵 杨， 邢恩鸿， 金小平， 申兴斌

(承德医学院附属医院， 河北 承德 067000)

食管癌(esophageal carcinoma)是消化道常见的恶性肿瘤，死亡率高。我国EC的病理组织类型主要是鳞状细胞癌，约占食管总发病率的83%［1］。食管癌的发生发展受多种因子的调控与维持。很多研究发现，基质蛋白酶2(MMP－2)及其抑制剂TIMP－2的高表达在肿瘤侵袭、转移过程中起着重要作用［2，3］。本研究运用免疫组化法检测了50例食管鳞癌组织中MMP－2、TIMP－2的表达情况及其相关性，探讨其在食管鳞癌的浸润、转移中所起的作用，为食管鳞癌的诊断、治疗及预后判断提供新的理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料:收集我院50例食管鳞癌患者中男性47例，女3例。年龄45－78岁，平均年龄56岁。病理学分级;其中高中分化36例，低分化14例;按浸润程度不同分为≤肌层组织9例，＞全层41例。有淋巴转移组27例，无淋巴转移组23例。所有病人术前均未接受放化疗治疗;同时取距上述癌组织边缘大于5cm处的正常粘膜20例标本作为对照。

1.2 主要试剂:兔抗人MMP－2多克隆抗体(北京中杉金桥);兔抗人TIMP－2多克隆抗体(武汉博士德公司);即用型DAB显色试剂盒(购自福州迈新生物技术开发有限公司DAB－0031)。

1.3 实验方法:石蜡切片(5微米)，电热恒温箱80℃烘烤50min，二甲苯脱蜡至水。3%过氧化氢室温孵育10min。蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min，在微波炉里加热0.01 moL/L枸橼酸钠缓冲液(pH6.0)至沸腾后将上述组织切片放入，抗原热修复15min，室温放置 40min，PBS冲洗 3次，每次5min。滴加 Ι抗50μL(MMP－2 1:80工作液;TIMP－2 1:100工作液)，4℃冰箱过夜。PBS洗3次每次5min。滴加Ⅱ抗(快捷型酶标羊抗鼠/兔Ig G聚合物)，室温孵育15min。PBS洗3次，每次5min。DAB显色5min，苏木素复染，透明、封片、镜检。

1.4 免疫组化结果判断:MMP－2、TIMP－2主要定位于细胞质，细胞质内出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞。采用阳性染色强度结合阳性细胞所占百分比进行判断。在400倍视野下，每张切片随机观察4个视野，将切片中平均阳性比例及染色深浅分别计0－3分，切片中无阳性细胞0分，阳性细胞＜25%计1分，26－50%计2分，51－75%计3分，＞75%计4分;染色强度以多数细胞为准;无着色计0分，淡黄色计1分，黄或深黄色计2分，褐或棕褐色计3分，再按这两项指标的积分相加将结果分为4级:0分为“－”，1－2分为“+”，3－4分为“++”，5－6分为“+++”，其中“++”“+++”为强阳性表达。

1.5 统计学分析:实验资料的统计学处理通过SPSS11.5统计软件完成，等级资料采用秩和检验(Wilcixon signed ranks text，Kruskal Wallis text)，以 P＜0.05为差异有显著性。采用Spearman等级相关分析MMP－2、TIMP－2的相关性。

2 结果

图1 正常食管粘膜(HE×200)

图2 食管鳞癌(HE×200)

2.1 免疫组化结果

2.1.1 MMP－2、TIMP－2在食管鳞癌和食管正常粘膜中的表达:MMP－2在20例正常食管粘膜与50例食管鳞癌中其强阳性、中等阳性及弱阳性表达分别为17例、16例、12例，5例阴性，两组比较表达强度有显著差异(P＜0.01)。TIMP－2在正常食管粘膜中部分免疫反应呈弱阳性信号，在食管鳞癌组织中有8例强阳性表达，10例中等阳性表达，21例弱阳性表达。TIMP－2在两组中的表达强度有差异(P＜0.01)。

2.1.2 食管鳞癌中MMP－2、TIMP－2与临床病理参数的关系:MMP－2在食管鳞癌的表达与浸润深度、有无淋巴结转移、TNM分期有关，与患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤分化程度无关。在有淋巴结转移的26例食管癌组织和无淋巴结转移的24例食管鳞癌标本中，MMP－2的强阳性表达分别是11例和6例，两组阳性表达比较有显著差异(P＜0.05)。在9例浸润≤肌层组和41例浸润＞肌层组MMP－2强阳性及中等阳性表达分别是16例、15例和1例、1例，两组阳性表达比较有显著差异(P＜0.05)。TNM分期Ⅰ+Ⅱ期26例与Ⅲ+Ⅳ期24例强阳性表达为5例和11例，两组比较也有显著差异(P＜0.05)。MMP－2在不同性别、年龄(＜60岁，≥60岁)、肿瘤组织分化程度分组中的表达无明显差异 (P ＞0.05，P ＞0.05，P ＞0.05)。

TIMP－2在食管鳞癌的表达与浸润深度、有无淋巴结转移、TNM分期有关，与患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤分化程度无关。在26例有淋巴结转移和24例无淋巴结转移的食管鳞癌标本中，TIMP－2的阳性表达数分别是23例和16例，两组阳性表达数比较有显著差异性(P＜0.05)。在9例浸润≤肌层组和41例浸润＞肌层组，TIMP－2强阳性及中等阳性表达分别为8例、10例和0例、1例，两组比较差异有显著性(P＜0.05)。在TNM分期Ⅰ+Ⅱ期26例与Ⅲ+Ⅳ期24例食管癌标本中，Ⅰ+Ⅱ期8例阴性，13例弱阳性，Ⅲ+Ⅳ期3例阴性，8例中等阳性，5例强阳性，两组比较也有显著差异(P＜0.05)。TIMP－2在不同性别、年龄(＜60岁，≥60岁)、肿瘤组织分化程度分组中的表达无明显差异 (P＞0.05，P ＞0.05，P ＞0.05)。

2.1.3 MMP－2、TIMP－2在食管鳞癌中表达的相关性分析:对MMP－2、TIMP－2在食管鳞癌中的表达情况，采用spearman等级相关分析。MMP－2和TIMP－2相关系数r=0.51;P＜0.01，表明他们之间有明显相关性。

表1 MMP－2在食管正常粘膜和食管鳞癌中的表达

表2 TIMP－2在食管正常粘膜和食管鳞癌中的表达

表3 食管鳞癌中MMP－2与临床病理参数的关系

*P ＜0.05

表4 食管鳞癌中TIMP－2与临床病理参数的关系

3 讨论

食管癌是当今世界导致人类死亡的主要恶性肿瘤之一，它的发生发展是一个多阶段多因素的过程。目前认为食管癌患者的预后受多种因素影响，随着基因研究的兴起，分子生物学指标对预后的影响是目前研究的热点。

基质金属蛋白酶MMPs是一个降解细胞外基质的酶家族，其功能活性受组织抑制物抑制。基质金属蛋白酶抑制剂TIMPs是MMPs的抑制剂，与MMPs共同参与ECM合成和降解。MMP－2具有降解多种ECM成分的强大能力，TIMP－2能特异性与MMP－2催化中心的锌离子结合，而封闭等催化中心，从而使MMP－2失去降解ECM的活性。MMP－2/TIMP－2表达失衡是引起ECM异常积聚的重要因素之一［4］。

研究表明，肿瘤中MMPS和TIMPS之间平衡失调，是肿瘤进展的一个重要因素［5］。近来基因调控的实验也进一步证实了MMP－2、TIMP－2失衡在肿瘤发生发展中的重要作用。本研究表明，MMP－2与TIMP－2在食管鳞癌中的表达明显高于正常食管组织，同时，在浸润超过肌层、有淋巴结转移、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期的食管鳞癌组织中明显高于浸润未超过肌层、无淋巴结转移、TNM分期Ⅰ+Ⅱ期的食管鳞癌组织，说明MMP－2与TIMP－2在食管鳞癌的发生、发展过程中也起着非常重要的作用。

本研究应用免疫组化技术检测MMP－2、TIMP－2在食管鳞癌及正常食管粘膜中的表达情况。结果表明，50例食管鳞癌组织中MMP－2、TIMP－2的阳性表达例数分别是45例和39例，而在正常食管粘膜中的阳性数仅为7例和5例，经统计学分析发现，与食管正常粘膜相比，MMP－2、TIMP－2在食管鳞癌组织中存在高表达(p＜0.01，P ＜0.01)。

本研究为了探讨MMP－2、TIMP－2在食管鳞癌发生发展之间的关系，检测MMP－2、TIMP－2在食管鳞癌中的表达情况，从而判断MMP－2、TIMP－2是否可能成为食管鳞癌诊断、治疗及预后的理想分子靶标。本研究分析了不同年龄、不同性别、不同分期、不同分化程度及淋巴结转移情况不同的食管鳞癌中MMP－2、TIMP－2的表达情况，旨在探讨MMP－2、TIMP－2与食管鳞癌的上述临床特征之间的相关性，以便较好地了解食管鳞癌从早期向晚期演变过程中MMP－2、TIMP－2的变化情况。免疫组化检测结果表明MMP－2、TIMP－2在浸润程度深、临床分期晚、有淋巴结转移的组织中的表达明显高于浸润程度浅、临床分期早、无淋巴结转移的组织。表明MMP－2、TIMP－2的表达与食管鳞癌的转化过程以及肿瘤细胞的侵袭有关。

本研究中MMP－2与TIMP－2在食管鳞癌浸润超过肌层组、有淋巴结转移组、TNMⅢ+Ⅳ期组的表达均高于浸润未超过肌层组、无淋巴结转移组、TNMⅠ+Ⅱ期组，但相对于MMP－2阳性表达的增高TIMP－2阳性表达增高的幅度较小，从而导致MMP－2、TIMP－2比例失衡，同时也提示MMP－2与TIMP－2表达比例的失衡与食管鳞癌的浸润、转移有关。

［1］孙秀娣，牧人，周有尚，等.中国胃癌死亡率20年变化情况分析及其发展趋势预测［J］.中华肿瘤杂志，2004，26(1):429 －435.

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［3］Nutt J E，Mellon J K，Qureshi K.Matrix metalloproteinase－1 is induced by epidermal growth factor in human bladder tumor cell lines and is detectable in urine of patients with bladder tumour［J］.Cancer Res，1998，78(2):215 －220.

［4］Lenz O，Elliot SJ.Matrix metalloproteinases in real development and disease［J］.Am Soc Nephrol，2000，11(3):5742 －5811.

［5］Yamamoto H，Itoh F，Iku S，et al.Expression of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in human pancreatic adenocarinomas clinicopathologic and prognostic significance of matrilysin expression［J］.Clin Oncol，2001，19(4):1118 －1127.