鸡胚中禽波氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析

杨萍萍，谭燕玲，赵 雪，刘静静，贺晓华，刘冠华，朱瑞良

(山东农业大学动物科技学院，山东 泰安，271018)

禽波氏杆菌(Bordetella avium，B．avium)曾被称为Ⅰ型粪产碱杆菌，与百日咳波氏杆菌、副百日咳波氏杆菌和支气管败血波氏杆菌同属于产碱杆菌科的波氏杆菌属。最早于1967年分离自火鸡［1］，并于1984年被正式命名为禽波氏杆菌［2］。在中国，1991年朱瑞良最先从患病鸡中发现并分离到该菌［3］。该菌在国外主要作为火鸡的呼吸道性病原存在［4，5］，而在我国养殖环境中多病原共存尤其是免疫抑制性病毒广泛存在［6，7］，使得禽波氏杆菌病的流行愈来愈严重且出现新的动向［8］。

自2009年5月以来，山东某大型海蓝褐种禽孵化场种禽出现除产蛋率下降外无其他明显外观症状，但所产种蛋在孵化过程中出现明显的胚胎死亡(18．7%)、孵化率降低(80．3%)以及孵出弱雏率增多(16．5%)等现象。取其18日龄将出壳胚胎作为备检材料进行病原的分离鉴定，确定为禽波氏杆菌感染所致，并对所分离的禽波氏杆菌菌株进行了23S rRNA序列扩增和耐药性分析。

1 材料与方法

1．1 病料

山东某大型海蓝褐种禽孵化场18日龄鸡胚350枚，其中活胚、死胚数量各占50%，作为被检材料。

1．2 菌株

试验中所用9株禽波氏杆菌菌株来源见表1，为山东农业大学预防兽医学实验室多年来分离鉴定并保存。

1．3 试剂及培养基

生化鉴定管(上海伊华);B．avium平板凝集抗原和阳性血清(山东农业大学预防兽医实验室提供);细菌基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒(Tiangen);PCR反应所用试剂、pMD18-T载体(TaKaRa);脑心肉汤、绵羊血体积分数为0．05的绵羊血鲍姜氏(B-G)琼脂培养基、麦康凯琼脂、普通营养琼脂(Difco)均按说明书配制，4℃保存备用。

1．4 鸡胚中细菌的分离培养及病毒的PCR扩增

将送检的鸡胚编号并蛋壳消毒后，用接种环分别从鸡胚的眼睛、体表以及肝脏等处分离细菌，划线接种于绵羊血体积分数为0．05的绵羊血鲍姜氏(B-G)琼脂平板、麦康凯琼脂平板和普通营养琼脂平板，于37℃培养24～48 h，检查生长情况及菌落特征，并挑取优势菌落进行传代纯化培养，以备鉴定。细菌分离培养完成后，提取鸡胚DNA，按文献［9］中所建立的REV，CIAV，ALV-J和MDV四重PCR和IBDV，VAV RT-PCR方法进行病毒的基因扩增，以分析是否存在病毒感染。

1．5 细菌的抹片、染色、镜检

挑取所分离到的细菌纯培养菌落涂片，火焰固定后按常规革兰氏染色法染色，光学显微镜观察细菌形态。

1．6 分离菌的生化鉴定

将分离菌株的纯培养物分别接种于各种生化鉴定管，进行甲基红实验，V-P实验，糖(醇及苷)类代谢，枸橼酸盐(利用)，硝酸盐(还原)，硝酸盐(产气)，H2S，过氧化物酶，尿素酶，乙酰胺等生化特性的检测，37℃培养24～48 h后观察结果。

1．7 分离菌的血清学鉴定

对所分离细菌制备凝集抗原［10］，与禽波氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌和葡萄球菌的阳性血清分别进行平板凝集反应。

1．8 分离菌23S rRNA的PCR扩增及序列分析

根据GenBank已发表的B．avium(NC-010645)的23S rRNA序列，用DNAStar软件设计1对引物，目的基因大小为710 bp，由上海英骏生物技术有限公司合成。

上游引物:5’-GGAACTTACCCGACAAGGAAT-3’(946-966)

下游引物:5’-TGGAGGTATCAGAAGTGCGAAT-3’(1 634-1 655)

细菌基因组DNA提取参照细菌基因组提取试剂盒说明书进行，反应体系(25 μL)，反应条件为94℃ 10 min后，再运行35个循环，每个循环为94℃ 1 min，55℃ 1 min和72℃ 1 min，最后72℃延伸10 min，质量浓度为8 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测。反应产物的纯化根据胶回收试剂盒的操作说明进行。PCR产物与pMD18-T载体的连接以及感受态细胞(E．coli TGI)的制备及转化，均按文献［7］方法进行。经序列测定后同实验室所保存9株(来源见表1)B．avium菌株及GenBank中B．avium NC-010645株进行序列同源性比较。

1．9 耐药性分析

采用47种药物对所分离到的细菌菌株按纸片扩散法进行药敏实验，参照药敏片厂家说明书进行操作，并根据美国临床实验室标准化研究所(CLSI)的药敏实验标准进行结果判定［11］，从而对分离菌的耐药状况做出评价。所选用的47种药敏片的药物为阿米卡星、氧氟沙星、链霉素、四环素、环丙沙星、利福平、氯霉素、氧呱噙青霉素、卡那霉素、头孢拉定、万古霉素、头孢羟氨苄、复达欣、呋喃妥因、甲氧西林、复方新诺明、头孢克肟、阿莫西林、先锋V、红霉素、菌必治、妥布霉素、庆大霉素、氟哌酸、头孢呋肟、青霉素、克林霉素、麦迪霉素、米诺环素、头孢曲松、头孢噻肟、头孢噻吩、头孢呋辛、克拉霉素、氨苄西林、头孢哌酮、大观霉素、多粘菌素B、左氟沙星、头孢噻啶、氨曲南、苯唑西林、诺氟沙星、头孢西丁、哌拉西林、头孢吡肟、头孢氨苄。

表1 禽波氏杆菌菌株来源

2 结果与分析

2．1 鸡胚中细菌的分离培养及病毒的PCR扩增结果

从大部分死胚(172/175)和少部分活胚(31/175)的眼睛、体表和肝脏均可分离到细菌，从菌落形态判断为同一种细菌，且数量上以体表最多，其次是眼睛，肝脏中最少。该种细菌在绵羊血体积分数为0．05的绵羊血鲍姜氏(B-G)琼脂培养基上生长良好，菌落光滑、凸起、湿润、半透明白色珍珠状;而在普通营养琼脂平板上于24 h后可见比针尖稍大菌落，形态同血琼脂培养基上类似;在麦康凯琼脂平板上24 h表现为针尖稍大的微暗红色菌落，随时间延长，菌落颜色减淡。经多重PCR和RT-PCR扩增，未扩增到病毒的基因片段。

2．2 分离菌的鉴定

涂片后染色镜检发现所分离菌革兰氏染色阴性，短小杆状。生化鉴定结果见表2，该分离菌不能利用任何糖、醇以及苷类碳水化合物;能利用枸橼酸盐作为唯一碳源生长，但不能利用酒石酸盐;硝酸盐(还原)为阴性，硝酸盐(产气)为阳性;能利用乙酰胺;在对酶类的试验中氧化酶、过氧化氢酶、精氨酸脱羧酶为阳性，精氨酸双水解酶为阴性;不能在质量浓度为65 g/L的NaCl培养基中生长。在血清学鉴定中能与B．avium阳性血清发生特异性凝集。根据所分离菌的形态结构、培养性状、染色特性、生化鉴定和血清学反应等结果，初步鉴定所分离菌为B．avium，命名为LL09株。

表2 分离菌的生化鉴定结果

2．3 分离菌的23S rRNA的PCR扩增及序列分析

新分离B．avium同实验室所保存的另外9株禽波氏杆菌的PCR扩增产物经质量浓度为8 g/L的琼脂糖凝胶电泳后均得到710 bp大小的目的条带，与预期的片段大小相符。经序列测定(Genebank No．HM545299)和系统发育分析(图1)，新分离LL09株的核苷酸序列与XT09株的同源性为100%，与其它8株B．avium的同源性为96．2% ～96．6%，与GenBank中收录的B．avium NC-010645的同源性为95．8%。

图1 分离菌LL09与B．avium菌株的23S rRNA进化树分析比较

2．4 耐药性分析

分离菌的药敏实验结果表明，该菌对所检测的14类47种药物中有28种呈现完全耐药，6种为低敏，只有13种药物比较敏感(表3)。耐受药物中包括了头孢类、青霉素类、单酰胺环类、大环内酯类、糖肽类、磺胺类等常用药物。只有喹诺酮类、氨基糖苷类和呋喃类中的部分药物的杀菌效果较好。

表3 分离菌的耐药性分析

3 讨论

B．avium能够在禽类的上呼吸道定植，并导致火鸡咳嗽以及禽类的鼻炎、眼炎等症状［12，13］，已经众所周知。近年来在对一些大型种禽孵化场进行胚胎性疫病病原分析时，经常发现其在胚胎中的感染，导致孵化率降低、弱雏率增高等状况［9］。

试验中从山东某种禽孵化场送检的将出壳鸡胚中分离到1株B．avium，经染色镜检、生化实验及血清学鉴定，完全符合B．avium的特征，命名为LL09株。在进行23S rRNA序列分析时发现，LL09株与同年从另一地区孵化场死胚中所分离的XT09株呈现100%同源性，而同以往实验室分别从患眼炎鸡的眼睛和患鼻炎鸡的鼻腔所分离的经典菌株以及Genebank中菌株NC-010645相距相对较远，表明该分离株与以往菌株以及国外菌株NC-010645在基因上存在一定差异。这与文献报道［14］国内分离的禽波氏杆菌菌株与国外分离菌株在遗传基因上存在差异基本一致。

为保证耐药性分析的准确性，本次研究采用了14类47种药物对分离菌进行药敏实验，涉及青霉素类、头孢菌素类、单环酰胺类、大环内酯类、氨基糖苷类、糖肽类、磺胺类、四环素类、氯霉素类、呋喃类、喹诺酮类、多肽类等各个种类。耐药性分析结果表明，所分离到的菌株存在广泛的耐药性，常用的几类药物大多耐药严重。与以往实验室分离菌株相比［15］，该菌的耐药谱更为广泛，随着年份的增长，B．avium的耐药性呈上升趋势。另一方面也表明，种鸡场耐药性菌株的广泛存在，孵化场急需对药物的应用进行剂量和种类的规范化管理。

综上分析，该B．avium分离株在鸡胚中的感染一方面可能与该菌株与传统呼吸道分离株的基因存在差异有关;另一方面与种鸡场多年的用药习惯有关，药物的滥用使菌株产生适应性和耐药性得以在鸡体长期潜伏存在，从而导致孵化场胚胎性疾病的发生。

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