异丙酚对糖尿病大鼠缺血再灌注心肌NF-κB、TNF-α 和 IL-6的影响

王红杰 张建新 解丽君 刘芳 苏红 苏小华

心肌缺血再灌注损伤是多因素导致的病理过程，存在多种信号转导途径且有交互作用(cross-talk)，其中，炎性反应贯穿于心肌缺血再灌注损伤的全过程［1］。研究表明，高血糖和氧化应激的主要靶点是核转录因子NF-κB，并通过其调控与炎症、细胞增殖、细胞分化等密切相关的多种基因的表达［2］。NF-κB也存在于心肌细胞中，它的活化及其调控的一系列信号分子的表达在心肌缺血再灌注损伤中发挥了关键性的作用［3，4］。静脉麻醉药异丙酚通过抑制再灌注诱发的炎性反应可减轻心肌缺血再灌注损伤［5］，但其对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注时炎性反应的影响尚不明确。本研究拟通过观察异丙酚对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注时心肌细胞内NF-κB活性及其下游的炎性因子的影响，探讨异丙酚对糖尿病心肌保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 糖尿病模型的制备 健康雄性SD大鼠100只，体重230～280 g，随机分为糖尿病组76只和非糖尿病组24只。禁食12 h，糖尿病组腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)55 mg/kg，72 h后剪尾尖采血测定血糖，以后每周测血糖，连续3周血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病大鼠(76只大鼠造模成功60只);非糖尿病大鼠腹腔注射等量缓冲液。

1.2 心肌缺血再灌注损伤模型制备 10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，气管插管，机械通气，经右侧颈总动脉插管，由 Powerlab/30八通道生理记录仪同时记录心率(HR)、平均动脉压(MAP)。左侧颈内静脉插管，静脉输注异丙酚。结扎左冠状动脉前降支30 min，再灌注120 min，制成心肌缺血再灌注损伤模型。

1.3 动物分组与给药 24只非糖尿病大鼠随机分为假手术组(Ⅰ组)和缺血再灌注组(Ⅱ组)，60只糖尿病大鼠随机分为假手术组(Ⅲ组)、缺血再灌注组(Ⅳ组)、异丙酚低(Ⅴ组)、中(Ⅵ组)、高(Ⅶ组)剂量组，每组12只，Ⅴ组、Ⅵ组、Ⅶ组分别从缺血前 10 min 开始持续静脉滴注异丙酚 3、6、12 mg·kg-1·h-1，Ⅰ～Ⅳ组静脉输注等量的0.9%氯化钠溶液。

1.4 主要试剂与仪器 异丙酚(批号0701221，四川蜀乐药业股份有限公司)，链脲佐菌素(STZ，Sigma公司，美国)，鼠NF-κB p65单克隆抗体(美国 Santa Cruz公司)，鼠血清及组织TNF-α、IL-6 ELISA检测试剂盒(美国R＆D公司)，SP免疫组化检测试剂盒和DAB显色试剂盒(北京中杉金桥公司);One-Tonch血糖仪及One-Tonch血糖试纸(LifeScan公司，美国)，八通道生理记录仪Powerlab/8s(澳大利亚 AD Instrument公司)，凝胶扫描分析系统BIO-PROFIF(法国VL公司)，酶标仪Multiskan Ascent V1.24(芬兰雷勃公司)，显微镜Olympus BX40(日本Olympus光学株式会社)等。

1.5 观察指标

1.5.1 血流动力学指标:分别于缺血前、缺血30 min、再灌注120 min记录HR、MAP，并计算血压-心率指数(血压×心率)。

1.5.2 血清TNF-α、IL-6含量测定:再灌注120 min后，右颈动脉取血，双抗体夹心ELISA法检测血清中TNF-α、IL-6含量。具体步骤严格按试剂盒说明书操作，酶标仪450 nm处测定OD值，绘制标准曲线，计算样品中TNF-α、IL-6含量。

1.5.3 心肌组织中TNF-α、IL-6含量测定:再灌注120 min时取左心室前壁组织约100 mg，冰水浴中用0.9%氯化钠溶液制成10%匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清，双抗体夹心ELISA法检测心肌组织中TNF-α、IL-6含量。具体步骤严格按试剂盒说明书操作，酶标仪450 nm处测定OD值，绘制标准曲线，计算样品中TNF-α、IL-6含量。

1.5.4 免疫组化染色观察心肌组织NF-κB的表达:采用SABC(链酶亲和素-过氧化物酶)法对心肌石蜡切片进行免疫组化染色，一抗为鼠抗NF-κB p65单克隆抗体，二抗为生物素化羊抗小鼠IgG，以0.1 mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。NF-κB p65的阳性表达呈棕黄色颗粒，位于胞浆和胞核。每张切片取10个高倍视野，计数胞核阳性表达细胞数。

1.5.5 Westernblotting检测心肌组织NF-κB的表达:提取心肌组织核蛋白并进行Westernblotting分析，阳性区域显深棕色。拍摄滤膜照片，并通过凝胶成像系统扫描，确定杂交条带的相对灰度值。

1.6 统计学分析 应用SPSS13.0统计软件，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，P＜0.05为差异有统学意义。

2 结果

2.1 血糖及体重的变化 腹腔注射STZ后72 h时Ⅲ组～Ⅶ组出现多饮、多食和多尿等症状，且随机血糖≥16.7 mmol/L。与基础值比较，腹腔注射STZ后3周时Ⅲ组～Ⅶ组随机血糖升高，体重降低，Ⅰ组和Ⅱ组体重增加(P＜0.05或＜0.01)，随机血糖差异无统计学意义(P＞0.05);与Ⅰ组和Ⅱ组比较，腹腔注射STZ后3周时Ⅲ组～Ⅶ组随机血糖升高，体重降低(P＜0.01)，Ⅲ组～Ⅶ组间随机血糖和体重差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 7组随机血糖及体重比较n=12，±s

表1 7组随机血糖及体重比较n=12，±s

注:与基础值比较，*P ＜0.05，#P ＜0.01;与Ⅰ组比较，△P ＜0.01;与Ⅱ组比较，☆P ＜0.01

组别 随机血糖(mmol/L)体重(g)基础值 腹腔注射STZ后3周 基础值 腹腔注射STZ后3周Ⅰ组 4.4±0.9 4.6±0.8 249±14 308±51#Ⅱ组 4.6±1.2 4.8±0.9 246±12 307±36#Ⅲ组 4.6±0.7 25.3±4.8#△☆ 254±14 223±40＊△☆Ⅳ组 4.8±0.8 24.2±5.4#△☆ 251±16 220±35＊△☆Ⅴ组 4.5±1.1 24.8±4.7#△☆ 247±13 223±26＊△☆Ⅵ组 4.4±1.0 25.1±4.2#△☆ 251±15 218±27#△☆Ⅶ组 4.7±1.3 25.3±5.1#△☆ 248±14 222±24＊△☆

2.2 血流动力学变化 缺血前糖尿病5组大鼠HR、MAP及血压-心率指数均低于非糖尿病组(P＜0.05或＜0.01)。分别与Ⅰ组和Ⅲ组相比，缺血再灌注后Ⅱ和Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ组大鼠的HR、MAP、血压-心率指数均呈进行性下降(P＜0.01)，糖尿病各组上述指标变化更加显著(P＜0.05或＜0.01)。Ⅵ组和Ⅶ组在缺血再灌注120 min时HR、MAP和血压-心率指数明显高于Ⅳ组(P＜0.05或＜0.01)且随剂量升高呈量效关系。见表2。

表2 7组HR、MAP和血压-心率指数比较n=12，±s

表2 7组HR、MAP和血压-心率指数比较n=12，±s

注:与Ⅰ组比较，*P ＜0.05，#P ＜0.01;与Ⅱ组比较，△P ＜0.05，☆P ＜0.01;与Ⅲ组比较，▲P ＜0.01;与Ⅳ组比较，★P ＜0.05，■P ＜0.01

组别 HR(次/min) MAP(mm Hg) 心率-血压指数(mm Hg×次/min)375±47 89.2±7.5 38.6±7.1Ⅱ组 326±46# 73.2±6.9* 26.8±2.3#Ⅲ组 324±44# 77.3±4.8 28.2±6.6Ⅳ组 253±53☆▲ 61.7±3.9☆▲ 19.1±4.6☆▲Ⅴ组 280±38 65.0±4.4 22.6±5.8Ⅵ组 292±27★ 67.4±2.7★ 25.1±4.9★Ⅶ组 314±26■ 71.4±5.0■ 26.4±3.9Ⅰ组■

2.3 血清中TNF-α、IL-6含量变化 分别与Ⅰ组和Ⅲ组相比较，Ⅱ组和Ⅳ组大鼠血清中TNF-α、IL-6含量分别明显升高，Ⅲ组和Ⅳ组上述指标分别明显高于Ⅰ组和Ⅱ组，Ⅵ组和Ⅶ组TNF-α、IL-6含量明显低于Ⅳ组(P ＜0.05或＜0.01)。见表3。

2.4 心肌组织TNF-α、IL-6含量的变化 Ⅱ组和Ⅳ组大鼠心肌组织TNF-α、IL-6含量分别明显高于Ⅰ组和Ⅲ组，其中Ⅳ组较Ⅱ组变化显著，与Ⅳ组比较，Ⅵ组和Ⅶ组大鼠心肌组织TNF-α含量明显降低(P＜0.05或＜0.01)。见表3。

表3 7组血清、心肌组织TNF-α、IL-6含量的变化

2.5 心肌组织中NF-κB表达的变化 免疫组化结果显示，Ⅰ组和Ⅲ组大鼠心肌组织中NF-κB呈低表达状态，且阳性表达出现在胞浆中;而Ⅱ组和Ⅳ组NF-κB活化，表达增强，阳性颗粒出现在胞浆和胞核，出现了核移位。Ⅵ组和Ⅶ组，NF-κB表达活性较Ⅳ组低，胞核阳性表达数明显减少(P＜0.05)，即缺血再灌注后NF-κB从细胞浆向细胞核的移位被限制。Western蛋白印迹结果显示，Ⅰ组和Ⅲ组仅有微量的NF-κB的表达，分别与Ⅰ组和Ⅲ组比较，缺血再灌注后的Ⅱ组和Ⅳ组NF-κB表达量均显著增加(P＜0.05或＜0.01)。Ⅵ组和Ⅶ组NF-κB的表达明显低于Ⅳ组(P＜0.05或＜0.01)。见表4。

表4 7组心肌组织NF-κB的表达n=12，±s

表4 7组心肌组织NF-κB的表达n=12，±s

注:与Ⅰ组比较，*P ＜0.05;与Ⅱ组比较，#P ＜0.05;与Ⅲ组比较，△P ＜0.01;与Ⅳ组比较，☆P ＜0.05，▲P ＜0.01

组别 NF-κB(positive cells/hpf) NF-κB p65(relative density)1.6±0.7 1.00±0.02Ⅱ组 10.9±3.8* 3.02±0.12*Ⅲ组 5.8±1.4 1.53±0.31Ⅳ组 16.4±4.7#△ 6.02±0.52#△Ⅴ组 14.3±4.5 4.83±0.12Ⅵ组 12.6±3.6☆ 3.53±0.37☆Ⅶ组 10.3±5.3▲ 2.96±0.24Ⅰ组▲

3 讨论

腹腔注射STZ是制备大鼠糖尿病模型的常用方法［6］，本研究结果显示，腹腔注射STZ后72 h时Ⅲ组～Ⅶ组大鼠随机血糖≥16.7 mmol/L，并出现多饮、多食和多尿等症状，腹腔注射STZ后3周时随机血糖仍≥16.7 mmol/L，体重明显降低，提示大鼠糖尿病模型制备成功。

本研究结果表明，糖尿病各组大鼠基础HR、MAP及血压-心率指数均低于非糖尿病大鼠，心肌缺血再灌注使心功能进一步下降，在缺血再灌注期间输注6、12 mg·kg-1·h-1异丙酚改善了糖尿病大鼠心功能，说明本研究中复制糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤模型可靠，异丙酚对糖尿病大鼠缺血再灌注心肌具有保护作用。

NF-κB是一个重要的多向性核转录调节因子，普遍存在于真核细胞中，可调节细胞因子、趋化因子、氧化应激相关酶等基因的表达，调控并介导多种病理生理过程。静息状态下NF-κB异源性二聚体与抑制性蛋白I-κB结合存在于胞浆中，呈无活性状态。当细胞在一些刺激因素(如细胞因子、活性氧自由基等)作用下，I-κB发生磷酸化，随之而产生泛素化，最终在蛋白酶体的作用下降解，从而释放NF-κB二聚体，使其得以转位进入细胞核中，与靶基因启动子或增强子的κB位点发生特异性结合，启动靶基因的转录［7］。研究表明，NF-κB是高血糖和氧化应激时细胞内靶点，同时，TNF-α、IL-6等参与缺血再灌注损伤的细胞因子均含有κB位点，受NF-κB的调控［8］。IL-6被认为是一种炎性状态的标志，在免疫应答与免疫细胞生长中起重要作用，而TNF-α是一种促炎性细胞因子，其主要来源于巨噬细胞丰富的肝、脾以及心肌原位巨噬细胞和心肌细胞本身。TNF-α通过抑制心肌细胞GLUT4mRNA和蛋白质的表达，使葡萄糖利用减少，而脂肪酸和酮体成为心肌能量的主要来源［9］。而未经治疗的糖尿病动物模型，心肌葡萄糖利用进一步下降，脂肪利用率上升至90% ～100%，使心肌 ATP水平下降近30%，心肌细胞结构和功能受到明显损害［10］。本研究结果显示，Ⅲ组血清TNF-α水平明显高于Ⅰ组，而心肌TNF-α水平虽有升高趋势，但尚无统计学意义，说明糖尿病是全身炎性反应疾病，3周病程糖尿病大鼠基础心功能的降低可能与全身炎性反应所致血清TNF-α水平升高造成的心肌抑制有关。心肌缺血再灌注后，Ⅱ组和Ⅳ组血清及心肌TNF-α水平明显均升高，说明缺血再灌注是心肌产生TNF-α的重要刺激因子。异丙酚中、高剂量组血清及心肌TNF-α水平明显低于Ⅳ组，说明异丙酚能够抑制糖尿病大鼠心肌缺血再灌注后TNF-αmRNA和蛋白表达，降低血清及心肌TNF-α水平，从而对糖尿病缺血再灌注心肌具有保护作用。

Murphy等［11］研究发现异丙酚结构类似于内源性抗氧化剂维生素E，可直接与自由基反应生成2，6-二异丙基苯酚基团，使自由基灭活。研究证实异丙酚通过增强细胞抗氧化作用、减少自由基脂质过氧化物的产生而减轻心肌缺血再灌注损伤［12］。因此，异丙酚可能通过减少糖尿病大鼠心肌缺血再灌注时氧自由基的产生或抑制氧自由基的活性，降低了氧自由基对NF-κB的激活作用，减少了TNF-α、IL-6的产生，从而具有心肌保护作用。

综上所述，异丙酚6、12 mg·kg-1·h-1通过抑制3周病程糖尿病大鼠缺血再灌注心肌 NF-κB的激活，减少TNF-α、IL-6的释放而具有保护作用。

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