吉林省常见的5种委陵菜trnL-F序列比对

王伯川，金 刚，刘春明，凌云辉，石 岩，张 本，张绍轩* (.吉林大学再生医学科学研究所，吉林 长春 00;.吉林省肿瘤医院，吉林 长春 00;.吉林大学中日联谊医院，吉林 长春 00;.吉林省中医药研究院，吉林长春 00)

委陵菜(Potentilla chinesis)为蔷薇科委陵菜属植物，具有清热解毒、凉血止痢之功能［1］。由于疗效确切，在《中国药典》历版中均被收载［2］。该属植物较多，仅吉林省境内就有10种之多。由于它们的亲缘关系接近，在同一生境内或不同生境内生长的各个物种间从外观上很难区别，加之所含化学成分接近，因而，用传统的外观鉴别、显微鉴别、薄层色谱鉴别很难达到满意效果［3］，导致误采、误用，影响疗效。为此，本研究采用trnL-F序列分析，对吉林省地产委陵菜属植物进行鉴别，以弥补上述方法的不足。

1 材料与方法

1.1 样品

委陵菜伏委陵菜，小叉叶委陵菜，霉叶委陵菜，蔓委陵菜为硅胶快速干燥的叶片。分别集于长吉高速公路和长春南湖公园处。均由长春中医药大学邓明鲁教授鉴定(见表1)。

表1 样品的采集地点和时间

1.2 DNA提取

称取0.3 g各样品叶片，置于培养皿中，加水少许，浸泡至充分展开，剪去病斑，用棉球擦拭叶片，去除杂质，再用70%乙醇擦拭叶片表面，然后用超纯水清洗3次，置于超净台上干燥;在液氮中研磨成细粉，然后按说明用北京鼎国植物基因组DNA提取试剂盒提取其总 DNA，溶于适量的超纯水中。取5 μL用1%琼脂糖凝胶电泳，检查DNA质量和数量。

1.3 引物设计

选择trnL通用引物［4］，由宝生物(中国 大连)合成，其序列如下:

PCR引物:

trnLF-cF:5'-TCC ACT GAA CCT TAT CAT TTA G-3'

trnLK-fR:5'-CCA TGC TTA AAC TCA GCG GGT-3'

测序用引物:

trnLF-cF:5'-TCC ACT GAA CCT TAT CAT TTA G-3'

trnLF-dR:5'-GAC TCG ATG GTT CAC GGG ATT CT-3'

trnLK-eF:5'-TCT CGC ATC GAT GAA GAA CG-3'

trnLK-fR:5'-CCA TGC TTA AAC TCA GCG GGT-3'

1.4 DNA扩增

扩增采用50 μL 体系，其中1.3 引物各1 μL，模板各 5 μL，10 × Buffer 5 μL，dNTPs 5 μL，Taq DNA 多聚酶1 μL，超纯净水32 μL。反应条件:94℃预变性5 min。94 ℃ 1 min，55 ℃ 2 min，72℃ 2 min，循环35次。72℃延长循环10 min，4℃保存。

1.5 测序

1.4 PCR产物经Montage PCR Filter Units(Millipore Corporation，U.S.A.)纯化后，进行测序反应。反应采用10 μL体系，用 ABI BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems，U.S.A.)测序，其中含 5 ×sequencing buffer 2.0 μL BigDye(3.1)0.5 μL，纯化模板 1.0 μL，1.3 引物 1.0 μL，纯净水5.5 μL。反应条件:预变性 96℃ 1 min。96℃30 sec，50℃ 5 sec，循环25次。60℃ 延长4 min。

1.6 序列分析

采用网页http://bioinfo.genopole-toulouse.prd.fr/multalin/multalin.html和Genetyx-SV/RC version 11.0(Software Development Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)进行序列的比对和编辑。

2 结果

5种委陵菜trnL-F序列比较见图1。

图1 5种委陵菜trnL序列比较

3 讨论

除委陵菜外，其他种的trnL-F序列都是首次报道。如图1所示，委陵菜各种间trnL-F序列差异明显，故trnL-F序列分析及其衍生的方法可以用于鉴别委陵菜。委陵菜种类繁多，仅吉林省内就有十余种之多，所以本研究仅仅是一个开始，在今后的研究中需要扩大研究样本的种类，蓄积更多的资料，只有这样才能更准确地对委陵菜各种间进行鉴别。

［1］赵 川，乔 卫，张彦文，等.委陵菜抗糖尿病有效部位及有效成分的研究［J］.中国中药杂志，2008，33(6):680-682.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.2010版.北京:中国医药科技出版社，2010:199.

［3］杨 婷，孙海峰，曹思思，等.10种委陵菜生药学研究［J］.时珍国医国药，2008，19(12):3039-3041.

［4］Taberlet P，Gielly L，Pautou G，et al.Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA［J］.Plant Mol Biol，1991，17(5):1105-1109.