DF活体浮游植物在线监测结果与叶绿素a的关系研究

刘爱玲，李 梅，熊丽黎

（1.江西省鄱阳湖水文局，江西星子 332800；2.江西省水文局，江西南昌 330002）

1 概述

鄱阳湖是中国最大的淡水湖。近年来，随着湖区周边工业经济水平的不断提高，各种污水流入鄱阳湖，使得水体富营养化越来越严重，藻类生长繁殖加快，影响用水质量。因此，加强水体中藻类含量的监测，对人民群众的用水安全具有保障作用。

衡量水体中浮游植物现存量的方法很多，可以用藻细胞密度、生物量、叶绿素a，或其他指标表示[1]。叶绿素a存在于所有的浮游植物中，是估算浮游植物生物量的重要指标[2,3]。叶绿素a能吸收光能，在激发光的照射下能产生荧光，荧光的强弱与其含量有着密切的关系。

浮游植物叶绿素a的测定方法主要有分光光度法和荧光法[4]两种，它的测定比用计数法测定藻类的数量要简便和快捷，为目前一种常用测定藻类现存量的办法[5]。

延迟荧光（Delayed Fluorescence，DF）是植物光合器官在光照停止后的发光现象，是活细胞的专属特性，是光合效率的指示指标，叶绿素在其中起关键作用[6]。1951年，科学家研究发现了植物光诱导延迟荧光现象[7]，其激发光谱取决于受试细胞的色素情况，此特征可以用于区别不同的藻属，并可通过数学计算来评估群落光合中不同色群的贡献率。延迟荧光技术可有效屏蔽再悬浮、死的生物和腐殖质对测量精度的干扰，而其他荧光测量技术无法实现。因此，延迟荧光技术已成为目前水华监测的研究热点。

匈牙利科学家利用延迟荧光技术对浮游生物的辨别与测量能力研制了DF活体浮游植物及生态环境在线监测系统。通过研究光合速率、量子效率、延迟荧光强度、叶绿素含量及初级生产量之间的关系，寻找延迟荧光强度与叶绿素含量及初级生产力的关系，并通过浮游植物色素的激发光谱来辨别不同的藻属[8]。该系统已在匈牙利巴拉顿湖、以色列金纳雷特湖、蒂萨河（匈牙利区域）进行了推广应用，并取得了较好的效果[9-12]，而在国内尚无使用先例。

2011年，为了填补藻类在线监测的空白，江西省鄱阳湖水文站引进了DF活体浮游植物在线监测系统，依托于鄱阳湖蛇山水量水质水生态自动监测站进行了鄱阳湖藻类试验监测研究。本研究立足于DF监测数据中的6组荧光值，通过分析纯种藻中荧光值与其叶绿素a的关系，尝试建立叶绿素a与监测荧光值的校准公式，以便在野外监测中予以应用。

2 材料与方法

2.1 试验材料

在不同季节，鄱阳湖藻类优势种也各自不同。本研究根据鄱阳湖藻类生长现状，选取具有代表性的藻种开展相关研究。以微囊藻（Microcysis aeruginosa）、鱼腥藻（Anabeana）、四尾栅藻（Scenedesmus quadricanda）、卵圆隐藻（Oval Cryptophyta）、小环藻（Cyclotella）分别代表蓝藻、绿藻、隐藻和硅藻，该纯种藻均购自中国科学院水生生物研究所。

本研究采用的DF活体浮游植物在线监测系统可识别包括蓝藻、绿藻（包括绿藻、裸藻等）、硅藻（包括硅藻、金藻、黄藻等）和隐藻类4种藻类。

2.2 试验方法

根据DF活体藻类在线监测系统监测所得不同波长荧光值计算出不同藻类所对应的叶绿素a值，与YSI6600所测的叶绿素a值进行比较，并建立校准公式，同时考虑监测过程中的误差，进行参数调整，使校准公式能够更为精准地体现叶绿素a状况。

2.2.1 相关性分析

用EXCEL分析DF活体藻类在线监测系统所检测的6种不同波段荧光值与不同藻类所对应的叶绿素a含量的相关关系，结果表明两者呈线性相关y＝ax。

2.2.2 纯种藻叶绿素a和荧光值之间的校准公式的建立

将纯种培养的蓝藻（微囊藻、鱼腥藻）、隐藻、硅藻（小环藻）和绿藻（栅藻）配置成不同浓度的标准样品,用DF系统进行检测，同时用YSI6600测定叶绿素a含量。本研究通过分析每个样品中6组荧光值与叶绿素a值之间的相关关系，应用加权平均建立纯藻荧光值和叶绿素 a 的校准公式（y＝ax1＋bx2…fx6）。

2.2.3 混合藻叶绿素a和荧光值之间的校准公式的建立

将纯种藻标准样品按一定比例混合，根据各种藻在各个波段下荧光值/叶绿素a的值，运用加权平均，计算出各种藻在各个波段下所分配的荧光值。依次将所分配的荧光值代入单种藻的校准公式中，并将计算结果与实际检测值进行对比，找出测定值与计算值之间的相关关系，将新的a值（a＇）代入公式中得到 y＝a＇（ax1＋bx2…fx6）， 得到混合藻中荧光值和叶绿素a的校准公式。

2.3 校准公式在野外监测中的应用

DF活体藻类在线监测系统在使用过程中其结果受到泥沙、光照等因素的影响，为了减少监测误差，我们将野外监测结果中的荧光值代入所建立的公式中，计算相应的叶绿素a，并与实际检测值进行对比，找出计算测定值与计算值之间的相关关系，将新的a值（a″）代入公式中得到 y＝a″a＇（ax1＋bx2…fx6），得到野外监测过程中荧光值和叶绿素a的校准公式。

3 结果分析

3.1 纯种藻叶绿素a及其荧光值的校准公式

图1是厂家根据DF活体藻类分析仪测定纯种藻的荧光值，以及各个样品的叶绿素a值和其他经验值，所作出的不同藻类在不同波段下荧光值/叶绿素a的关系，反映了在不同波段下，每种藻中单位叶绿素a含量所占的荧光值。

图1 不同荧光值与纯种藻叶绿素a的关系图

由图1可知，同一波段下不同的藻类，荧光值对叶绿素a的贡献是有很大差异的。

在图1的基础上研究不同的藻类在不同波段下荧光值与叶绿素a值的相关关系。在研究相关关系时，分别以 y1，y2， y3，y4，y5分别表示微囊藻、鱼腥藻、栅藻、隐藻和硅藻的叶绿素 a 值，x1，x2，x3，x4，x5和x6分别表示荧光种类 SB、B、TG、YG、R和SR对应的各个波段荧光值。以栅藻为例，根据监测结果（见表1），计算出不同波段荧光值与叶绿素a的关系（见表2）。从表2可以看出荧光值与叶绿素a之间呈线性相关，相关关系较好。根据计算出的线性关系，结合图1显示的各波段荧光与叶绿素a关系，通过加权平均，建立栅藻叶绿素a（y）与各个波段荧光值（x）的线性关系。

采用同样方法可建立其他藻类叶绿素a与各个波段荧光值的校准公式，结果如下：

微囊藻：y1＝0.00067x1＋0.0005x2＋0.00033x3＋0.00017x4＋0.00017x5＋0.00017x6

鱼 腥 藻 ：y2＝0.0031x1＋0.71 ×0.0022x2＋0.0029x3＋1.54×0.0047x4＋0.0032x5＋0.66×0.0021x6

隐藻：y4＝0.0042x1＋ 0.74×0.0031x2＋0.82×0.0035x3＋1.26×0.0052x4＋1.21×0.005x5＋0.0038x6

硅 藻 ：y5＝0.0027x1＋0.62×0.0018x2＋0.67×0.0020x3＋1.68×0.0040x4＋1.17×0.0030x5＋0.55×0.0016x6

表1 不同浓度栅藻荧光值与叶绿素a原始检测值

表2 不同荧光值与栅藻叶绿素a的关系

2.2 混合藻叶绿素a及其荧光值的校准公式

将DF测得的混合藻样品荧光结果代入所建公式中进行计算，结果见表3。与仪器测定的叶绿素a结果相差较大。所以要确定混合藻中各种藻的叶绿素a（y）与荧光值（x）的相关关系，需要进一步校准相关参数。

根据图1中各种藻在各个波段下荧光值/叶绿素a的值，计算出每种藻中每份叶绿素所占荧光值占该波段总荧光值的比例，结果见表4。

将所计算出的比例代入混合藻的荧光值中，计算各种藻在各个波段下所分配的荧光值。依次将各种藻在各个波段所分配的荧光值代入单种藻的校准公式中，重新计算各种藻相应的叶绿素a含量，与实际叶绿素a含量进行比较，结果见表5。

由表5可知，根据公式计算出来的叶绿素a值测定值有一定差异，需要进一步对其校准参数进行分析。在此，建立各种藻中叶绿素a计算值与实际值相关曲线，详见图2至图5。微囊藻、鱼腥藻、栅藻、隐藻的线性参数分别为4.116、0.5955、1.4336、0.7206，因此，混合藻中微囊藻、鱼腥藻、栅藻和隐藻的叶绿素a与荧光值的校准公式分别调整为：

表3 方程计算的叶绿素a与测定值结果对比 μg/L

表4 各种藻占总荧光值的比例%

表5 叶绿素a方程计算值与测定值结果对比 μg/L

图2 微囊藻中叶绿素a计算值与实际值相关关系

图3 鱼腥藻中叶绿素a计算值与实际值相关关系

图4 栅藻中叶绿素a计算值与实际值相关关系

图5 隐藻中叶绿素a计算值与实际值相关关系

4 校准公式在野外监测中的应用

为验证所建立的校准公式在野外监测结果中的应用效果，本次试验选取了2012年某时段连续8 d的监测结果，分别应用校准公式计算出相应的微囊藻、鱼腥藻、栅藻和隐藻的叶绿素a值，并将结果相加，与多参数水质分析仪同步监测的叶绿素a值进行比较见表6。

由于校准公式是建立在纯培养藻类的基础上，没有考虑任何外界环境如泥沙等的影响，而且也没有加上硅藻的叶绿素a值。而鄱阳湖水体含沙量高，湖水中的泥沙，TSS等极大的干扰了DF仪对藻类的测定。因此，为了找到这些因素的影响参数，将计算的叶绿素a值与多参数水质分析仪测定的叶绿素a值建立相关曲线，如图3。

将图3中得到的野外校准参数0.0386为系数，加入校准公式，则野外监测下叶绿素a与荧光值的校准公式调整为：

利用校准公式计算得到的叶绿素a结果见表6，与多参数水质分析仪测定的叶绿素a建立相关曲线，见图4。由图可见，加入野外校准参数后，计算出的叶绿素a值与实际测定值相关曲线斜率已经接近 1，R2为0.7787，表明实测数据和计算数据具有较强的相关性，表明所建立的校准公式经调整后可以适用于野外监测。

表6 野外监测中方程计算的叶绿素a和YSI6600监测结果 μg/L

图3 方程计算的叶绿素a值与野外实测值相关关系图

图4 野外校准公式计算的叶绿素a与测定值关系图

4 结论

DF活体藻类在线监测系统所检测的6种不同波段荧光值与不同藻类对应的叶绿素a值呈线性相关。该系统在匈牙利等国家使用过程中取得良好的效果，但是DF活体藻类在线监测系统在使用过程中其结果受到不同藻类荧光遮挡的影响以及泥沙、光照等水文气象因素的影响。在不同的地方荧光强度与叶绿素a之间的计算参数是不一样的。我们通过多次校准获得符合鄱阳湖实际情况的参数，初步实现了DF活体藻类在线监测系统在鄱阳湖叶绿素a自动监测过程中的使用。

系统在使用过程中应尽量调整参数至精准，使用者可通过所在地的实际情况和监测数据按照本文介绍的方法来进行参数调整，得出符合实际的校准方程。该系统具有进一步在其它河流湖泊推广应用的价值。

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