原发性乳腺癌组织中类干细胞检测及临床意义

屈志钢 杨超 左燕红 黄丽娟 王鹏 赵凤云 刘运江

在我国乳腺癌发病率以每年3%的速度递增，且发病年龄趋向年轻化。尽管目前乳腺癌的综合治疗显著改善了患者的生存期，但复发和转移风险仍然很高。目前干细胞理论认为，肿瘤中只要一小部分具有干细胞表型的肿瘤细胞移植后，就能够重新形成肿瘤，并且具有自我更新、形成不同分化程度的肿瘤的能力，肿瘤组织中肿瘤干细胞的存在及数量是肿瘤复发和转移的根源［1］。但乳腺癌干细胞一直缺乏有效的鉴别和分离方法，我们参照Xu等［2］的实验，采用流式细胞技术检测乳腺癌组织中的CD55hig的细胞比例来代替乳腺癌类干细胞，用以判断患者的预后及复发的风险。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究选取2008年2月至2009年1月在河北医科大学第四医院外一科诊治的原发性乳腺癌患者45例，均为女性，年龄30～72岁，中位年龄46岁。根据国际抗癌联盟(2002版)肿瘤分期标准：Ⅰ期11例，Ⅱ期26例，Ⅲ期8例;根据腋淋巴结有无转移分为：无淋巴结转移16例，淋巴结转移1～3枚16例，淋巴结转移≥4枚13例;按乳腺肿瘤病理组织学分类标准：浸润性导管癌33例，浸润性小叶癌7例，其他类型乳腺癌5例;根据C-erbB2表达情况分为：阳性(++～+++)患者33例，阴性(-～+)患者12例;根据ER表达情况分为：阳性(+～+++)患者30例，阴性(-)患者15例;根据PR表达情况分为：阳性(+～+++)患者26例，阴性(-)患者19例;根据Ki67蛋白的表达情况分为：阳性(+～+++)患者32例，阴性(-)患者13例。选取病例中，8例曾行新辅助化疗(化疗方案为CEF方案或AC方案，化疗周期为2～4个周期)，其余均为首次就诊、未经过任何治疗的患者。研究对象的腋窝淋巴结转移状况、病理学指标根据我院组织活检和手术标本的病理报告确定，患者的临床资料来自住院病历。

1.2 实验方法 主要仪器、主要试剂及试剂配制 见表1。

表1 主要仪器、主要试剂及试剂配制

1.3 实验步骤

1.3.1 单细胞混悬液的制备：于手术中按无菌原则切取部分乳腺癌肿块，同时切取部分远离癌灶5 cm的乳腺组织作为CK19，CD55免疫荧光标记时的阴性对照，低温保存，快速到实验室处理。分别将保存的新鲜肿瘤组织及正常乳腺组织放在120目不锈钢网上，下置一平皿，用搓网法将组织搓完，将平皿中的混悬液用300目铜网过滤去除细胞团块，收集细胞悬液后以1 000 r/min离心沉淀2 min，加入PBS 10 ml洗涤1次，弃上清，再加入PBS10 ml洗涤1次，弃上清。

1.3.2 细胞的免疫荧光标记：取乳腺癌组织单细胞混悬液及正常乳腺组织单细胞混悬液各1×106/ml，同时加入鼠抗人CD55-FITC原液、鼠抗人CK19-PE原液各20μl，避光、室温孵育30 min。加入适量PBS缓冲液以1 000 r/min离心沉淀2 min。上机检测前加入经500目铜网过滤后的PBS 0.1 ml。将乳腺癌组织及对照组织混悬液以鼠抗人CD55、鼠抗人CK19工作液(两种不同的荧光显色标记)进行双标，然后采用流式细胞术方法进行上机检测，其中远离癌组织5 cm的乳腺组织的单细胞悬液设为阴性对照。用流式细胞仪测定乳腺癌肿瘤细胞表面CD55表达：选择氩离子激光激发，激发波长为488 nm，测定中以前向角散射(FSC)对侧向角散射(SSC)设门，调整电压及增效，圈出CK19+、CD55hig细胞群。

1.4 结果判定标准 本研究参照Xu等［2］的研究方法及结果判定标准，采用乳腺癌细胞株MDA-MB-231进行CD55检测，检测中以癌细胞表面受体大量结合CD55抗体的主峰处的荧光密度值为界值，超出此界值即定义为CD55hig，以此为界值设门分析，避免非上皮细胞的干扰，获取门内细胞个数。实验结果用Expo 32 ADC软件进行分析，得到CK19+、CD55hig荧光双标阳性细胞的百分数。

1.5 统计学分析应用SPSS13.0统计软件，计量资料以±s表示。两个样本均数的比较应用Wilcoxon符号秩检验(散点图中样本成偏态分布)，3组样本均数的差别比较应用Kruskal-Waillis H检验(散点图中样本成方差不齐)，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD55hig水平比较 乳腺癌肿瘤组织中CD55hig的细胞群比例均数为(0.21±0.20)%，较乳腺癌细胞株MDA-MB-231所测CD55hig的比例(0.36±0.22)%低。

2.2 CD55hig细胞比例在淋巴结转移间比较 CD55hig的细胞比例在腋淋巴结无转移组，1～3个腋淋巴结转移组和≥4个腋淋巴结转移3组间比较，差异有统计学意义(χ2=16.86，P=0.000)。CD55hig细胞群比例在腋淋巴结无转移组、在1～3个腋淋巴结转移组、≥4个腋淋巴结转移组间两两比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 CD55hig群细胞的比例在淋巴结转移不同组间的比较%，±s

表2 CD55hig群细胞的比例在淋巴结转移不同组间的比较%，±s

注：(1)：(2)，P=0.000;(1)：(3)，P=0.000;(2)：(3)，P=0.019

≥4枚淋巴结转移(3)(n=13)0.390±0.069

2.3 不同C-erbB2时CD55hig细胞群比例表达 乳腺癌组织中C-erbB2(++～+++)组的CD55hig的细胞群比例(0.277±0.034)%，较 C-erbB2(-～+)组的 CD55hig的细胞群比例(0.028±0.005)%有明显的升高，差异有统计学意义(P=0.000)。见表3。

表3 CD55hig群细胞的比例在不同C-erbB2表达组间的比较%，±s

表3 CD55hig群细胞的比例在不同C-erbB2表达组间的比较%，±s

++～+++(n=33)0.277±0.034

2.4 CD55hig群细胞不同分期及 ER、PR、Ki67中的表达CD55hig的细胞比例在乳腺癌不同病理类型之间、不同临床分期之间、ER(-)，ER(+ ～ +++)组之间、PR(-)，PR(+ ～ +++)组之间、Ki67(-)，Ki67(+～+++)组之间的差异均无统计学意义(P＞0.05)，CD55hig细胞群的比例在术前化疗与未化疗比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表4、5。

3 讨论

3.1 乳腺癌类干细胞的分离鉴别依据 最近越来越多的证据显示肿瘤组织及肿瘤细胞系中的细胞存在着等级性，即不同分化阶段的细胞，其中一部分肿瘤细胞在启动肿瘤形成和维持肿瘤生长中起决定性作用，其作用与正常干细胞相似，被命名为肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSC)［1］，或称为肿瘤类干细胞(cancer stem-like cells，CSLC)。研究发现，乳腺癌组织中亦存在类干细胞，称之为乳腺癌类干细胞(mammary cancer stem-like cell，MCSC)。它具有永远增殖和自我更新能力，可能为乳腺肿瘤转移和复发的根本原因［3］，而且它还具有逃避免疫监视，躲避化疗药物杀伤的特性［4-6］，目前研究认为乳腺癌组织中类干细胞的含量越高，肿瘤转移和复发的机会越大，预后越差［7，8］。由此可见，通过测定乳腺癌中的类干细胞含量可以反映肿瘤组织的生长情况：当CSLC的比例很高时，机体对其失去了正常的调控能力，此时患者可能处于肿瘤进展及向外播散转移期;而当其比例很低时，肿瘤组织处于稳定生长状态或已被当前治疗所控制。因此测定CSLC的含量可以帮助我们判断病情和估计预后。

表4 CD55hig群细胞的比例在不同临床分期、不同病理类型、不同ER、PR、Ki67表达组间的比较

表5 化疗与未化疗患者CD55hig表达比较%，±s

表5 化疗与未化疗患者CD55hig表达比较%，±s

未化疗(n=37)0.209±0.035

一直以来乳腺癌类干细胞缺乏有效的鉴别和分离方法。2002年，Clarke等［9］首次成功地从乳腺癌细胞中分离出干细胞，2003年Al-Hajj等［10］从乳腺癌患者组织中分离出CD44+CD24-/low群细胞，经检测CD44+CD24-/lowESA+lin-群细胞致瘤性提高了50倍，说明了其具有不同于其他肿瘤细胞的生命力。2004年 Kondo等［11］用 Hoechst33342染料排斥法检出MCF-7乳腺癌细胞系中侧亚群(side population，SP)细胞。而干细胞理论认为干细胞及肿瘤干细胞因带有ABCG2转运蛋白而具有能将染料泵出表现为染料暗淡的特征，用Hoechst33342染料分选出来的染色暗淡的细胞被称为SP细胞，产生SP表型的主要原因是因为高表达ABCG2［12］。其他不能将染料泵出的细胞被称之为MP细胞，通过此方法分离出干细胞。2005年Patrawala等［13］改进了这种分离方法，使用Coulter Epics流式细胞仪将SP与MP分为独立的两群，经检测后发现MCF-7中SP比例为0.2%。

2007年 Xu等［2］从乳腺癌细胞株 MCF-7中分离出CD55hig、CD55low两部分，分别落在 SP、MP 部分，当 CD55hig群细胞随培养基耗尽而消失后，SP细胞亦随之消失，提示采用CD55抗体可以替代 Hoechst33342染料排斥法。随后 Xu等［2］将CD55hig群细胞和CD55low群细胞分别培养，经观测，CD55hig群细胞生长良好，并且可以培养出CD55hig和CD55low两群细胞，具有同MCF-7相近的细胞特点，而CD55low群细胞则不能;他们又将CD55hig群细胞和CD55low群细胞用锥虫蓝染色，观察细胞凋亡情况：当12 h血清耗尽后生存下来的 CD55hig群细胞远较CD55low群细胞多，提示CD55hig群细胞生存能力强，具有抵制因血清耗尽而引发的细胞凋亡能力;他们又采用神经酰胺来检测(神经酰胺是一种可引起细胞凋亡的药品)，加入神经酰胺后24、48、72 h 后，CD55hig群细胞远较 CD55low群细胞多，提示CD55hig群细胞比CD55low群细胞生存能力更强;同样的试验在乳腺癌细胞株MDA-MB-231中也得到验证。其后的克隆形成实验亦显示CD55hig群细胞的克隆形成效率高于CD55low群细胞，而且CD55hig群细胞还具有进一步分化的能力，因此认为CD55hig群细胞可能是一群具有肿瘤类干细胞样性质的细胞。因此我们可以通过检测乳腺癌患者肿瘤中的CD55hig的比例来检测乳腺癌类干细胞的含量。

CD55是一种促衰变因子(decay accelerating factor，DAF)，其生物学活性及生理功能证实可保护宿主细胞免遭补体介导的溶解破坏［14］。即肿瘤的免疫逃逸现象。有研究表明，CD55与肿瘤细胞的活动度、新生血管形成、细胞凋亡的解救、肿瘤的致瘤性、肿瘤的侵袭及转移等有关［15］。

3.2 原发性乳腺癌组织中的类干细胞比例的测定及其临床意义 尽管多项试验认为CD55hig可以成为乳腺癌类干细胞的标记物，但CD55存在于各种血细胞及其他肿瘤细胞上，表达不具备特异性，所以本试验需要滤去乳腺癌组织中其他非上皮细胞，仅留下乳腺上皮细胞，以筛选CD55hig群细胞。因此我们采用了CK19+作为筛选标记物。

CK19是一种细胞角蛋白，对乳腺上皮组织具有高度的组织特异性，因为乳腺癌病理类型中大部分为导管上皮来源，所以在乳腺癌中广泛表达，近年来的试验也证明CK19是检测乳腺癌微转移最有价值的标志物之一［16，17］。

本试验采用CD55，CK19+双标(荧光标记颜色不同)，在CK19+筛选过的乳腺上皮细胞中，选取其中的CD55hig(详见判定标准)群细胞作为乳腺癌类干细胞并测算其比例，从而为乳腺癌患者的病情判断提供理论依据。

研究结果显示，CD55hig在腋淋巴结无转移组，1～3个腋淋巴结转移组及≥4个腋淋巴结转移组之间进行两两比较发现：随着腋淋巴结转移的数量增多CD55hig有明显上升趋势，即随腋淋巴结转移的数量增多乳腺癌类干细胞的数量也增多。而乳腺癌类干细胞的多少控制着乳腺癌的复发和转移风险，因此认为，CD55hig的细胞比例与乳腺癌灶的转移和病情的进展有关，该实验中CD55hig的细胞比例的升高可以间接反映患者癌灶具有更强的向周围侵袭性和转移性，CD55hig的比例的升高间接反映患者术后的复发率和转移风险增加。

乳腺癌肿瘤组织中C-erbB2(++～+++)组的CD55hig群细胞的比例较C-erbB2(-～+)组的CD55hig群细胞的比例有明显上升，这与C-erbB2在乳腺癌组织中的表达具有相似性。HER-2/neu基因作为乳腺癌的一种判断预后的独立生物学指标，与乳腺癌的侵袭性有关，它的表达影响着乳腺癌的预后，目前研究显示，HER-2/neu高表达的患者复发率高，生存率低［18］。而本试验中CD55hig群细胞的比例升高意味着乳腺癌类干细胞的增加，预示着患者的肿瘤具有更强的恶性生长和转移的倾向，而且由于肿瘤类干细胞本身具有免疫逃逸和躲避化疗药物杀伤的特性，CD55hig组织也像C-erbB2(+～+++)的乳腺肿瘤组织一样对化疗具有抵抗性。

通过上述试验结论认为，检测乳腺癌患者肿瘤中CD55hig的细胞比例可以测定出乳腺癌类干细胞的含量，对判断乳腺癌患者的预后和病情的进展具有重要参考价值，即CD55hig的细胞比例升高可能预示着乳腺癌恶性程度高，预后差即具有高度转移和复发风险的一个慎重预后指标。但乳腺癌类干细胞的标志物的认定目前尚未达成共识，故本试验仍处于探索阶段，有待于扩大样本量且增加对比指标及对患者的长期随访以进一步证实。

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