血清EPCA－2联合尿液PCA－3检测在前列腺癌诊断中的临床意义

胡存利，王 超，牛文斌，郝 鹏，郭玉刚，曹会峰，迟宝进

（1.佳木斯大学附属第一医院泌尿外科，黑龙江 佳木斯154003；2.夷陵医院，湖北 宜昌443100）

随着我国人均寿命的不断增长与生活水平的逐步提高，近年来前列腺癌的发病率出现快速上升，故早期诊断和治疗以提高前列腺癌的治愈率值得高度重视。直肠指诊（digital rectal examination，DRE）、经直肠超声检查（transrectal ultrasonography，TRUS）和PSA测定等是目前前列腺癌诊断的重要手段，确诊主要依靠前列腺穿刺活检或病理。随着研究的日益深入，利用PSA筛查前列腺癌的价值遭到广泛质疑，而前列腺穿刺活检又会造成一定的创伤，且可能会并发感染、出血、血管迷走神经反射及肿瘤种植等。故临床上急需诊断前列腺癌更好、更准确的手段，以减轻患者的经济和心理负担。EPCA－2是一种与前列腺癌相关的核基质蛋白，有研究表明它能较病理切片提早5年或更多时间准确的诊断出前列腺癌[1]。PCA3是近几年来所发现的一种最佳的前列腺癌特异基因，其表达仅在前列腺上皮细胞，且具有肿瘤特异性。为了探讨血清EPCA－2联合尿液PCA－3检测在前列腺癌诊断中的临床意义，本研究采用ELISA检测前列腺癌患者血清EPCA－2的水平，同时采用RT－PCR检测前列腺癌患者尿液PCA3基因表达情况。并探讨二者的变化在前列腺癌诊断中是否具有协同效应，从而为前列腺癌的早期诊断提供更好的依据。

1 材料和方法

1.1 标本

2010－03～2012－12收治的BPH患者38例，年龄59～84岁，平均（71.0±6.6）岁，同期收治的前列腺癌患者26例，年龄56～83岁，平均（72.8±7.5）岁。两组患者在年龄、性别和病史等方面没有明显差异，具有可比性。所有患者均经穿刺活检或手术后病理确诊。健康体检者标本来自我院体检中心。

1.2 实验方法

所有病例均为入院第2天清晨空腹采血，采血前一周内未行导尿、DRE、前列腺按摩、TRUS及膀胱镜检查等，且一个月内未行前列腺穿刺，并排除入院前合并有急、慢性前列腺炎与急性尿潴留的患者，以最大限度减低可能干扰血清EPCA－2浓度的因素。血液采集以后，3000转离心10min将血清和红细胞快速仔细地分离，然后将血清用移液器移至EP管内待检。标本如果无法立即检测可以保存于－20℃冰箱中。采用EPCA－2酶联免疫试剂盒（美国R＆B公司生产）分别检测三组患者血清EPCA－2水平。所用酶标仪为芬兰Labsystems Multiskan MS 352型。实验操作严格按照说明书进行。以EPCA－2＞30ng／mL为前列腺癌的判定标准。尿液PCA－3的提取分为两个步骤：（1）总RNA的提取：取前列腺按摩后的第一次尿液30mL，立即放入冰中冷却。于3000rpm／10min离心收集尿沉渣，加等量冷D－hanks液洗涤两次，放置在－70℃保存备用，按经典总RNA抽屉试剂盒说明书上提取总RNA后真空干燥，用15mL DEPC溶解，取2μL RNA溶液加入98μL水中，混匀后在微量分光光度计上测A260／A280比值及RNA含量。（2）RT－PCR检测：先合成cDNA，取11μL RNA模板样品，加oligo180.5μg／μL，具体操作按逆转录试剂盒说明书进行，总反应体积约20μL，最后取2μL来PCR扩增，在外显子1和4之间设计一对PCA3引物，上游引物TGGGAAGGACCTGATGATACA＇，下游引物，CCCAGGGATCTCTGTGCTT。最后将扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后经凝胶成像系统观察有无406bp目的产物[2，3]。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 EPCA－2在正常对照组、前列腺癌组和BPH组测定结果

前列腺癌组患者血清EPCA－2水平为（56.32±16.96）ng／mL，明显高于BPH组和正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 EPCA－2在正常对照组、PCa组和BPH组的水平（±s）

表1 EPCA－2在正常对照组、PCa组和BPH组的水平（±s）

组别 n EPCA－2（ng／mL）26 56.32±16.9610 9.02±1.46前列腺增生组 38 12.78±9.47前列腺癌组正常组

2.2 PCA－3在正常对照组、前列腺癌组和BPH组的表达情况

所有标本中，仅前列腺癌患者中见到一特异406bpPCA3电泳带，其中健康体检者和前列腺增生患者无PCA3表达，前列腺癌患者中都表达PCA3mRNA。

表2 PCA－3在正常对照组、PCa组和BPH组的表达情况

3 讨论

核基质（nuclear matrix）是充盈于细胞核内的一种三维蛋白网架结构，而构成核基质主要成分的核基质蛋白（nuclear matrix proteins，NMPs）对DNA复制、转录和基因表达等方面都具有重要的调控功能，且具有组织细胞特异性及肿瘤相关性。研究表明，核基质及核基质蛋白的变化与各种组织（包括前列腺）的癌变有关[4]。因此，NMPs已被初步用于区分正常前列腺和前列腺癌。EPCA－2是近几年发现的一种在前列腺癌中表达而在正常前列腺不表达的NMPs。研究人员[5]通过免疫抗体测定患者血液中的EPCA－2水平，结果发现97%的未罹患前列腺癌的患者EPCA－2结果为阴性，无症状的男性和患有其它恶性肿瘤及良性疾病的患者EPCA－2含量小于临界值，90%的局限性前列腺癌患者和98%浸润性前列腺癌患者EPCA－2含量等于或大于临界值。总体上94%的前列腺癌可以通过EPCA－2筛查出来。以上结果提示EPCA－2可以作为前列腺癌筛查的肿瘤标记物。

本研究结果显示，前列腺癌患者血清EPCA－2的水平为（56.32±16.96）ng／mL，明显高于 BPH 组的（12.78±9.47）ng／mL，差异具有统计学意义 （P＜0.01）。这提示EPCA－2与前列腺癌变存在联系，EPCA－2的测定有利于前列腺癌的诊断与鉴别诊断。若以EPCA－2＞30ng／mL为前列腺癌的判定标准，其预测前列腺癌的特异性达91.2%，敏感性达95.4%。但是，在临床上发现，EPCA－2在前列腺癌中诊断的特异性并非100%，可能会引起漏诊，若同时检测患者尿液PCA－3可以起到辅助诊断的作用。

PCA3基因是1999年bussemakers等[6]发现的一种前列腺癌特异基因，它是一种非编码RNA。通过Northernblot法分析该基因特异性表达与前列腺癌细胞，正常前列腺细胞，前列腺增生的细胞中不表达或者仅少量表达，在其他肿瘤组织中不表达。此外，2002年De KOK等[7]研究也得出PCA3在正常组织和良性前列腺增生组织中有非常少表达的结果。但是前列腺癌PSA基因的表达与前列腺增生组织相比无显著差异。与PSA基因相比，PCA3基因是一个前列腺癌特异性很强的基因。本实验是建立在RT－PCR基础上，检测前列腺癌按摩后尿液PCA3基因的表达进行分析。经前列腺按摩后，前列腺细胞通过前列腺管进入尿道。前段尿中含有前列腺细胞最多。由于不同的标本中含有前列腺细胞数量不一样，每微克RNA所含前列腺细胞的比例也不同，需要用管家基因对其校正，本实验选择PSA作为管家基因，已经证实PSA基因在正常前列腺细胞表达较恒定，在前列腺癌细胞中轻微下降。本实验对前列腺按摩后尿液PCA3基因定性分析结果显示：前列腺癌患者尿液PCA3基因表达呈阳性，前列腺增生患者尿液PCA3基因表达为阴性，差异具有统计学意义（P＜0.01）。这说明尿液PCA3基因可以鉴别前列腺癌患者和非前列腺癌患者。

本实验证实，EPCA－2存在于前列腺肿瘤细胞中，表明EPCA－2检测可以为前列腺癌早期诊断提供依据，同时也证实，在前列腺癌发生过程中，PCA－3表达也明显增高。因此可以推断，EPCA－2与PCA－3联合检测可以为前列腺癌的早期诊断提供依据，从而减少很多不必要的过度诊断和过度治疗，降低患者的心理负担和社会、经济成本。

[1]Dhir R，Vietmeier B，Arlotti J，et al.Early identification of individuals with prostate cancer in negative biopsies[J].J Urol，2004，171（4）：1419－1423

[2]罗振国，蒲永昌，王天喜.尿液PCA3基因检测在前列腺癌诊断中的意义[J].黑龙江医药科学，2010，33（3）：58－59

[3]罗振国，王超，陶然，等.血清PSA、fPSA／tPSA在前列腺癌诊断中的临床意义[J].黑龙江医药科学，2012，35（1）：32－33

[4]Brunagel G，Schoen RE，Bauer AJ，et al.Nuclear matrix protein alterations associated with colon cancer metastasis to the liver[J].Clin Cancer Res，2002，8（10）：3039－3045

[5]Getzenberg，Leman ES，Cannon GW，et al.EPCA－2：A Highly Specific Serum Marker for Prostate Cancer[J].J Urol，2006，175（4）∶275－275

[6]Bussemakers MJ，Van BA，Verhaegh GW，et al.DD3：a new prostate－specific gene，highly overexpressed in prostate cancer[J].Cancer Res，1999，59：5975－5979

[7]de Kok JB，Verhaegh GW，Roelofs RW，et al.DD3（PCA3），a very sensitive and specific marker to detect prostate tumors[J].Cancer Res，2002，62：2695－2698