LPS诱导人肾小球系膜细胞FoxM1B分子表达的研究

陈伟强，魏凤香，潘德顺，辛 华，王 莉，王 琳

（1.广东药学院基础学院，广东 广州510006；2.深圳市龙岗区妇幼保健院中心实验室，广东 深圳518000；3.广东药学院药科学院，广东 广州510006；4.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯154003）

肾脏系膜细胞（MCs）过度增殖而导致肾小球硬化（GS），引起肾单位结构和功能破坏，最终发展为慢性肾衰竭。GS是多种生物活性物质和细胞成分参与的复杂过程，肾脏局部和机体系统的内环境改变都可以影响其发生发展，其中MCs在炎症的剌激下过度增殖是其主要病理基础[1]。脂多糖（1ipopolysaccharide，LPS）是革兰阴性菌细胞壁的组成成分，为重要的炎症反应触发剂，并诱导多种细胞因子参与炎症反应。FoxM1B属于叉头框（forkhead box，Fox）蛋白家族成员之一，是与细胞增殖有关的特异性转录因子。LPS可刺激肾脏系膜细胞增生和基质合成，但其作用是否与FoxM1B表达变化相关，目前不十分清楚。本实验通过脂多糖（LPS）模拟炎症过程，观察肾小球系膜细胞增殖、FoxM1B分子表达的变化，以探讨LPS诱导人肾小球系膜细胞增生的可能机制。

1 材料和方法

1.1 材料

脂多糖（LPS，Sigma公司）；RPMI一1640、Trizol RNA提取试剂盒、PCR试剂盒购自Amresco公司。新生小牛血清（FCS）为杭州四季青生物工程材料研究所提供。

1.2 系膜细胞培养

以含10%胎牛血清的RPMI－1640培养基，于37℃、饱和湿度下、5%CO2培养箱中培养，细胞呈单层贴壁生长，2～3d传代一次。取对数生长期细胞。

1.3 实验分组

①对照组，细胞不作任何处理；②LPS（10μg／mL）处理12h组；③LPS（10μg／mL）处理24h组；④LPS（10μg／mL）处理48h组。

1.4 细胞增殖水平检测

取培养系膜细胞胰蛋白酶消化，加RPMI－1640完全培养液于离心管中，吹打混匀，按每孔200μL，密度103／mL接种于96孔板。待细胞贴壁24h后，换5%血清培养液200μL，同步24h。再按上述分组孵育，刺激时间为12、24、48h。置37℃、5%CO2孵箱培养，加人噻唑蓝（MTT），于4h后分别加人二甲基亚矾（DMSO），酶标仪620nm波长处记录吸光度值（D值）。

1.5 qRT－PCR法检测不同细胞处理组FoxM1BmRNA含量

不同处理组系膜细胞，加入TRIzol试剂裂解提取总RNA。用逆转录试剂盒以Oligo（dT）将总RNA逆转成cDNA。反应条件：42℃20min、99℃5min、4℃5min。以cDNA作为模板通过qRT—PCR法检测细胞中FoxM1BmRNA的含量，反应条件：95℃3min、95℃30S、65℃30S、72℃30S；扩增45个循环。以β－肌动蛋白作为内参，用ΔΔCt法进行结果分析。FoxM1B及β－肌动蛋白荧光定量PCR引物由本室设计。并由上海生物工程有限公司合成。FoxM1B上游引物：5’ATGAAAACTACCCCCGTC3’，下游引物：5’TGGGGTGGTTAATAACTTGG3’。β－肌动蛋白上游引物：5’CCAGC－CTTCCTTCTTGGGTAT3’，下 游 引 物：5’TTGGCATAGAGGTCTTACGG 37。

1.6 蛋白质印迹法（western blotting）检测

细胞处理后，用0.5%胰蛋白酶消化，4℃PBS漂洗3次，加入600μL细胞裂解液（2×106个细胞，内含磷酸酶抑制剂），置冰上30min后，4℃、15000×g离心30min，上清液即为总的细胞蛋白溶解成分。上清液加等量2倍十二烷基硫酸钠上样缓冲液在十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后电转膜到醋酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉封闭，以兔抗人（1：5000）为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（1：500）为二抗进行抗原抗体反应，发光试剂盒显色。Alphalmager2200图像系统分析灰度值，取β－肌动蛋白灰度值的比值进行统计学分析[2]。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 LPS诱导系膜细胞增殖的结果

用MTT方法检测。与对照组相比，在12、24、48h，10μg／mL的LPS能促进MCs增殖。结果见表1。

表1 LPS诱导的MCs增生（±s，n＝10）

表1 LPS诱导的MCs增生（±s，n＝10）

注：＊与正常对照组比较，P＜0.05。

组 别 12h 24h 0.27±0.02 0.31±0.04 0.38±0.03 LPS组 0.39±0.02＊ 0.48±0.03＊ 0.64±0.0448h正常对照组＊

2.2 两组细胞FoxM1BmRNA的水平

采用qRT－PCR法检测两组细胞FoxM1BmRNA的含量.以对照组mRNA水平为基础，LPS处理组mRNA水平用对照组的倍数来表示；结果显示：LPS处理细胞FoxM1B mRNA水平明显高于对照组（P＜0.001）。结果见图1。

图1 对照组和LPS处理组细胞FoxM1BmRNA水平

2.3 LPS对人系膜细胞FoxM1B蛋白表达的影响

FoxM1B和β－肌动蛋白灰度值的比值见表2、图2。

表2 LPS对MCs FoxM1B表达的影响（±s，n＝10）

表2 LPS对MCs FoxM1B表达的影响（±s，n＝10）

注：＊与正常对照组比较，P＜0.01。

组别 12h 24h 0.13±0.01 0.17±0.02 0.16±0.02 LPS组（FoxM1B／β－actin） 0.45±0.02＊ 0.63±0.03＊ 0.74±0.0448h正常对照组（FoxM1B／β－actin）＊

图2 LPS对MCs FoxM1B表达的影响

3 讨论

肾小球内MC增生和细胞外基质增多是多种肾小球疾病、肾小球毁损、硬化过程中的主要表现[3]。MC属于血管周细胞，是反应活跃的肾小球固有细胞，在炎症过程中不但是被动受害者，而且是直接参与者。我们发现：LPS能明显诱导系膜细胞的增殖，这与以前的报道是一致，目前认为：其作用机制与LPS调节多种炎症和细胞生长因子相关[4]。叉头框（forkhead box，Fox）蛋白家族是一类DNA结合区具有翼状螺旋结构的转录因子，目前已发现17个亚族。Foxm1属Fox转录因子的一个亚型，根据转录后不同的剪切形式又分为A、B、C三个亚型。其中FoxM1B与细胞增殖密切相关。FoxM1B可见于所有胚胎组织及正在扩增的细胞中，终末分化细胞及静止期细胞中几乎没有表达，但是当静止期细胞再次进入细胞周期时则又恢复高水平表达。成年组织中仅在胸腺及睾丸中高表达（由于此两种器官中存在活跃的细胞增殖过程），在正常肝脏中的表达水平很低，若部分切除肝脏后，由于残留肝细胞重新进入分裂周期，其表达水平又可见明显增加，此外在许多肿瘤组织及肿瘤细胞系中均有表达。因此，多数学者认为FoxM1B是与细胞增殖密切相关的特异性转录因子。FoxM1B的表达受c－Myc和核转录因子E2F的调控。细胞进入有丝分裂前c－Myc和E2F表达增高，二者可以结合在FoxM1b启动子区，上调FoxM1B的表达，进而促进细胞有丝分裂。研究证实FoxM1B的表达水平及其活性在G1末期即明显升高，且一直持续到有丝分裂完成。FoxM1B通过调控下游靶基因促进细胞分裂，目前已发现的20多个FoxM1B靶基因几乎都与细胞周期及分裂增殖有关，如FoxM1B可以促进cyclins和CDKs的表达。同时，cyclins及CDKs又可促进FoxM1B的磷酸化水平，一方面增强其转录活性，另一方面有助于其向核内转移[3]。我们研究发现：正常培养的系膜细胞仅能表达极微量FoxM1b，这与其它的研究结果是一致的，而LPS在诱导系膜细胞增生同时，能明显诱导FoxM1b表达增加，表明FoxM1B与LPS诱导的MCs增殖可能有关；但其详细的作用机制需要进一步的实验加以探讨。我们的研究结果将有助于进一步确认FoxM1B在MCs过度增殖从而引发肾小球硬化及肾单位损害中的作用，为延缓乃至阻止肾单位的进行性破坏提供新的生物治疗靶点。

[1]Picken MM.The role of mesangial homeostasis in glomerular injury progression：hope for mesangial sclerosis reversal[J].Kidney Int，2009，5（6）：574－576

[2]潘德顺，陈伟强.苯丁酸钠对人舌鳞癌Tca8113细胞株p21和survivin基因表达的影响[J].中国药理学通报，2010－02－20

[3]Wang JL，Cheng HF.A selective cyclooxygenase－2inhibitor decreases protein uria and retards progressive renal injury in rats[J].Kidney International，2000，57（6）：2334－2342

[4]Lee IT，Shih RH，Lin CC，et al.Role of TLR4／NADPH oxidase／ROS－activated p38MAPK in VCAM－1expression induced by lipopolysaccharide in human renal mesangial cells[J].Cell Commun Signal，2012，10（1）：33－38