硝/铵营养对香蕉枯萎病尖孢镰刀菌生长的影响

张茂星，陈 鹏，张明超，阮云泽，李 荣，朱毅勇*，沈其荣

(1南京农业大学资源与环境科学院，江苏南京210095;2海南大学农学院，海南海口571101)

香蕉枯萎病又名香蕉巴拿马病、黄叶病，是一种真菌引起的土传病害［1］。其病原菌是尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.Cubense)，有4个生理小种。自1967年在台湾首次发现香蕉枯萎病［2］之后，广东［3-4］、福建［5］、海南［6］等地也相继发生，侵染小种为1号和4号。4号小种主要侵染香牙蕉(AAA)，而我国种植的品种巴西蕉、巴贝多、威廉姆斯，都属于香牙蕉类，极易感染，因此国内大多数香蕉种植产业因此而遭受重创。由于该病原菌可通过带病吸芽、土壤、雨水和气流等进行传播，因此蔓延迅速，而且病原菌在土壤中可长期营养兼性寄生生活，一般的化学药剂难以彻底根除。虽然理论上可以通过培育抗病品种来避免香蕉枯萎病菌的浸染，但是在实践中周期很长，无法解决当前存在的问题［7］。目前也有不少生物防治［8］的方法，但是由于缺乏相应的理论基础，还处于摸索阶段。

从植物营养学的角度发现，氮素形态与含量可以影响很多病原菌的生长。Sabine等［9］研究者在2008年报道，10 mmol/L的铵态氮可以抑制水稻恶苗病原菌(Fusarium fujikuroi)透性酶MeaB合成比卡霉素，从而降低其致病性。而Talbot［10］早在1993就发现，在缺少硝态氮的条件下能够影响水稻稻瘟病和小麦赤霉病的病原菌侵染，这也被大量的研究者所证实［11-14］，研究认为在缺少硝态氮时，稻瘟病病原菌的致病基因表达增强。植物病理学研究表明，香蕉枯萎病尖孢镰刀菌在致病过程中首先要吸附并定植在植物根系表面，之后穿透细胞壁，最后寄生在植物细胞中生长繁殖，并产生一些次级代谢产物和毒素致使植物维管束堵塞，叶片枯萎，植株死亡［15］。有研究者发现，在番茄感染相应的尖孢镰刀菌时，病原菌的菌丝体在穿透植物细胞壁的过程中受到基因的参与，而铵态氮可以抑制该基因的表达，从而影响其侵染。因此，如何从植物营养的角度来研究并阐明氮素对病原菌生长与侵染的影响，并在实际生产中调控土壤中的氮素形态，含量的变化，对于调控枯萎病的发生具有重要的理论与实践指导意义。

而有关香蕉枯萎病是否受到氮素形态的影响，及病原菌对氮素的响应机制，到目前为止还未见报道。因此在本研究中，我们利用不同硝铵配比对海南香蕉枯萎病尖孢镰刀菌生长的影响进行了研究，并利用生物膜研究了其菌丝体在不同氮素处理下的穿透能力，为实践中如何通过调控氮素营养，控制枯萎病提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

香蕉枯萎病病原菌是由南京农业大学江苏省固体有机废弃物资源化利用高新技术研究重点实验室自行筛选，属于尖孢镰刀菌古巴专化型，并经过分子鉴定为香蕉枯萎病4号生理小种。

1.2 试验设计

室内培养试验按照霍格兰营养液的配方，并加一定量的葡萄糖(见表1)，加入琼脂(20g/L)后配成固体培养基，其中的氮源设置7个处理:对照，不加氮源(N0+A0);100% 硝态氮(N100%);75%硝态氮+25%铵态氮(N75%+A25%);50%硝态氮+50%铵态氮(N50%+A50%);25%硝态氮+75%铵态氮(N25%+A75%);100%铵态氮(A100%)，PDA(potato dextrose agar)。pH 用 tris-HCl调节至4或6。分别配置500 mL培养基后分装100 mL到250 mL三角瓶，高温高压蒸汽灭菌30 min。培养基成分按照表1的标准，其中氮源是在培养基灭菌后添加，总氮是10 mmol/L。硝酸钠和氯化铵溶液分别用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后加入培养基并倒入直径为9cm的培养皿中，每个培养皿中用直径为5mm的打孔器接种香蕉枯萎病尖孢镰刀菌菌块1块。每个处理重复3次，在28℃恒温培养箱下培养5 d后测菌落直径。

表1 培养基各组分浓度及硝铵配比Table 1 The concentrations of culture medium components and nitrate/ammonium ratios

在不同浓度铵对尖孢镰刀菌生长的影响的试验中，培养基成分除氮源为不同浓度的氯化铵外，其余各组分如上。试验设8个处理，铵态氮浓度分别为0、1、2、5、10、15、20、25 mmol/L。

模拟细胞壁穿透试验的处理方法同上，将总的氮源设为 5和 10 mmol/L，并将灭菌的赛璐膜(cellophane membrane 孔径 0.22 μm，直径为 50 mm)先覆盖在培养基表面并接种一块直径为5 mm的香蕉枯萎病尖孢镰刀菌。培养4 d后在无菌环境下将膜取出，第5 d观察菌落生长情况［16］。

试验数据用Excel 2003和SPSS18.0软件进行统计分析和显著性水平检验。

2 结果与分析

2.1 不同硝/铵配比和pH对香蕉枯萎病尖孢镰刀菌生长的影响

从图1可以看出，尖孢镰刀菌在PDA培养基中的生长不受pH影响。然而在不同硝铵配比处理中，低pH(pH=4)时均导致尖孢镰刀菌的生长受到抑制。在同一pH值条件下，100%铵处理(A100%)中尖孢镰刀菌的生长与其它硝铵配比处理差异显著，菌落直径均小于4 cm。但是在有硝态氮存在的情况下，尖孢镰刀菌的生长甚至比PDA处理的生长更好，且差异显著。虽然在不加氮源的处理中，尖孢镰刀菌的生长就其菌落直径而言，与PDA处理差异不显著，但是菌丝体颜色很浅，菌丝量很少，说明其生长量可能受到氮源不足的影响。

图1 不同硝铵配比和pH对尖孢镰刀菌生长的影响Fig．1 The effects of different ammonium/nitrate ratios and pH on FOC4 growth

2.2 不同铵态氮浓度对香蕉枯萎病尖孢镰刀菌生长的影响

通过室内恒温培养5 d后(图2)尖孢镰刀菌的菌落直径基本上都在小于等于5 cm的范围。总体上，尖孢镰刀菌在全铵培养基上受不同pH的影响较小，差异不明显。从图2-III中可以看出，尖孢镰刀菌的生长在第4 d开始受到抑制，并且在同一pH条件下，铵态氮浓度大于等于5 mmol/L时，尖孢镰刀菌的生长受到显著的抑制，菌落直径都小于4 cm。其中在pH为4时，铵态氮浓度为20 mmol/L与25mmol/L的处理差异不显著，这说明，当铵浓度达到20mmol/L以上时就产生了明显的抑制效果。

图2 不同浓度的铵对香蕉枯萎病尖孢镰刀菌生长的影响Fig．2 The effects of different ammonium concentrations on FOC4 growth

2.3 不同浓度的硝/铵配比对尖孢镰刀菌侵染膜的影响

从图3和图4可以看出，通过室内恒温培养，尖孢镰刀菌在不同硝铵配比的情况下侵染赛璐玢(cellophane)存在一定的差异。尖孢镰刀菌在N100%，N75%+A25%，N50%+A50%，N25%+A75%，PDA处理的固体培养基中培养4 d后揭膜，1d后都长有一定量的菌丝。然而在N0%+A0%和A100%的固体培养基中揭膜1d后都没有长菌丝。从而可以得出尖孢镰刀菌在侵染膜的过程中需要氮源，然而铵态氮可以阻止其侵染穿透。我们还通过不同浓度的氮源试验，各硝/铵配比的处理都得出了同样的结果。

3 讨论与结论

微生物的氮源谱十分广泛，一般可分为有机氮和无机氮两大类，其中无机氮主要是硝态氮和铵态氮。Schneper［17］等指出真菌可以根据其周围环境中不同种类和数量的氮源，自动调节达到氮源利用的最大化而获得生存。秦涵淳［18］等发现，培养基的营养成分中氮对香蕉尖孢镰刀菌的影响比碳的大。在一定C/N比条件下，有机氮含量越高，菌丝生长越快也越多。但是有关无机态氮对真菌生长的影响还不清楚。

在实际生产中，有研究者［19］通过改性石灰氮防治香蕉枯萎病取得一定效果，石灰氮在土壤中分解产生了氰胺类化合物对香蕉枯萎病尖孢镰刀菌起到触杀的效果。我们通过室内模拟土壤消毒试验和大田消毒实验(未发表)发现，一定量的氨水或者碳铵与石灰混合消毒，也可以预防和抑制尖孢镰刀菌的传播。这些结果都说明，一定浓度的铵态氮可能是抑制香蕉枯萎病生长的一个重要原因。另外，国外的研究者［20］等通过木霉T34在不同硝/铵配比情况下对番茄枯萎病的防控作用中发现，增加铵的浓度可以减少番茄枯萎病的病情指数。在本次试验中，尖孢镰刀菌在全铵的固体培养基中其生长受到了抑制(图1)，这与上述研究结果一致。

图3 不同浓度的硝/铵配比对尖孢镰刀菌侵染膜的影响(氮浓度为5mmol/L)Fig．3 Effects of different ammonium/nitrate ratios on the cellophane penetration of FOC4(The nitrogen concentration was 5 mmol/L)

由于植物细胞在吸收铵态氮时，会同时造成质外体及周围环境酸化。其原因主要是与NH+4的吸收方式有关，即NH+4与H+的反向运输或NH+4脱质子化后以 NH3的形式进入细胞［21-22］。因此，铵态氮抑制香蕉枯萎病尖孢镰刀菌的生长究竟是其本身的抑制作用还是由于酸化造成的还不明确。从图1可以看出，尖孢镰刀菌在低pH条件下生长受到抑制。林妃［23］等的研究认为尖孢镰刀菌在pH为6或7时生长最快，低于5或大于8时，则生长均受到一定的抑制，并且其产孢量也减少。这说明，铵态氮源抑制香蕉尖孢镰刀菌的生长(图1)，其中一部分原因也可能是由于铵态氮吸收后周围环境中的pH降低导致的。图2的结果进一步说明，当铵态氮浓度升高后，铵态氮本身对尖孢镰刀菌的抑制起主导作用，超过了低pH对尖孢镰刀菌的影响作用。

图4 不同浓度的硝/铵配比对尖孢镰刀菌侵染膜的影响(氮浓度为10 mmol/L)Fig．4 Effects of different ammonium/nitrate ratios on the cellophane penetration of FOC4(The nitrogen concentration was 10 mmol/L)

此外，Snoeijers［24］等在 2000 年就指出，氮源本身也是一些真菌侵染植物寄主细胞时的信号分子，氮代谢会激活致病基因的表达。Di Pietro［25］等在2001年证明了蛋白激酶Fmk1是尖孢镰刀菌侵染番茄寄主细胞时必不可少的，其表达直接影响到菌丝体穿透细胞壁。2010年 Di Pietro又发现［16］，在控制Fmk1基因表达的上游转录因子中有一个bZIP蛋白MeaB受到铵态氮的影响，并直接抑制了Fmk1的表达，而另一个受铵影响的蛋白激酶TOR也可以直接影响尖孢镰刀菌侵染番茄。他们发现铵态氮可以促进谷氨酰胺和蛋白激酶TOR的合成，从而引起转录因子MeaB的表达，但是MeaB的表达会抑制Fmk1基因的表达，从而影响病原菌穿透细胞壁。从图3、图4中可以看出，随着铵态氮比例或是浓度的增加，香蕉枯萎病尖孢镰刀菌穿透赛璐玢(cellophane)的菌丝减少，甚至在全铵培养时肉眼几乎无法观察到，这与Di Pietro在研究番茄枯萎病时的结果非常相似［16］。这说明，铵态氮很可能也通过类似的信号通路影响了香蕉尖孢镰刀菌穿透植株细胞壁的过程。因此，相关的分子生物学机制还需要在香蕉尖孢镰刀菌中进一步深入研究。

综上所述，铵氮态在一定程度可以有效地控制香蕉尖孢镰刀菌的生长与侵染过程，在实践中可以通过相应的施肥措施来调控香蕉枯萎病的发生，但是还需要在大田试验中进行验证，这也将是今后研究的一个方向。

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