Ad5F35-IκBαΔN重组腺病毒对K562/DNR细胞耐药性逆转的研究

刘志军

(湖南师范大学医学院，湖南 长沙 410006)

化疗是目前治疗白血病的主要手段之一，而化疗过程中患者对化疗药物产生原发及继发多药耐药是化疗失败和预后差的重要因素[1]。柔红霉素(DNR)是治疗急性白血病的常用药物，可诱导白血病细胞凋亡。但很多白血病细胞对DNR具有一定的耐药性，影响白血病的化疗效果。核因子-κB(NF-κB)是细胞核内重要的转录因子。研究表明，在DNR诱导白血病细胞凋亡的同时，NF-κB也被激活[2]，它的激活被认为是许多肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性的关键因素[3-4]。抑制NF-κB活化是否可以降低白血病细胞对DNR的耐药性？我们采用Ad5F35-IκBαΔN 重组腺病毒将 NF-κB 的抑制蛋白IκBα转入K562/DNR细胞，观察感染后NF-κB活性变化及对K562/DNR细胞凋亡率的影响，以期为白血病细胞耐药性的逆转提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

RPMI 1640培养基(美国Gibco公司)；柔红霉素(意大利Pharmacia公司)；AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡检测试剂盒 (美国 BD Phar Mingen公司)；NF-κB p65转录因子活性分析试剂盒(美国Active Motif公司)；细胞核提取试剂盒 (美国Active Motif公司)；K562/DNR细胞(中南大学湘雅医院血液实验室)；重组Ad5F35-IκBαΔN腺病毒(含第1～70位氨基酸位点发生突变的IκBα)(中南大学湘雅医院血液实验室)。

1.2 细胞培养

将其K562/DNR细胞置于含10%小牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基中。培养条件为37℃、5%CO2、饱和湿度。实验采用对数生长期细胞。

1.3 柔红霉素对K562/DNR细胞凋亡的诱导作用

根据柔红霉素作用的不同浓度和不同时间将标本分2组。12小时组：K562/DNR细胞和不同浓度的柔红霉素 (0.5μmol/L、1μmol/L和 2μmol/L)作用 12小时；24小时组：K562/DNR细胞和不同浓度的柔红霉素(0.5μmol/L、1μmol/L 和 2μmol/L)作用 24 小时。

1.4 流式细胞仪分析细胞凋亡

将待测标本离心，弃上清液并用PBS缓冲液洗涤二次并重悬细胞。然后取5×105细胞，离心，弃上清液，加入195μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。再加入5μL Annexin V-FITC，轻轻混匀。室温避光孵育10 min。离心，弃上清液，加入190μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入10μL碘化丙啶，轻轻混匀，冰浴避光放置。15 min后用流式细胞仪分析细胞凋亡。选择诱导K562/DNR细胞凋亡最佳浓度和时间的柔红霉素，进行后续实验。

1.5 IκBαΔN对柔红霉素诱导的K562/DNR细胞凋亡的影响

取3×105细胞置于无菌的1.5mL并标有"1"、"2"和"3"的试管内。分别加入滴度TCID50为5.6×108/mL的 Ad5F35-IκBαΔN 腺病毒 107μL(最终感染复数为200)。于细胞培养箱内培养2 h，用未加血清的RPMI 1640培养基洗涤二次。将各管细胞加入到标有"1"、"2"和"3"的6孔培养板再培养48 h。计数细胞，将5×105细胞后加入到6孔培养板内。再加入柔红霉素药液至终浓度为1μmol/L。轻轻混匀后，将6孔培养板置于细胞培养箱内培养12 h，1500r/min离心5min，弃上清液并用PBS缓冲液洗涤二次。将三管进行感染实验的细胞混合，分成二部分：一部分用流式细胞仪分析细胞凋亡，另一部分用来提取细胞核蛋白。

1.6 细胞核提取物NF-κB活性分析

收集细胞，按照NF-κB活性检测试剂盒说明书操作步骤提取细胞核蛋白。用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。每孔取等量样本20μL用ELISA法定量检测NF-κB活性。一抗为1:1000稀释的NF-κB p65亚单位抗体，二抗为1:1000稀释的辣根过氧化酶偶联的二抗。读取450nm波长的吸光度(A)值。计算A值/μg核蛋白并将1个A值/μg核蛋白定义为1个NF-κB活性单位。

2 结果

2.1 柔红霉素诱导K562/DNR细胞凋亡最佳条件

用终浓度分别为0.5μmol/L，1μmol/L 和2μmol/L的DNR处理K562/DNR细胞12 h和24 h后，流式细胞术检测结果显示：细胞凋亡率随DNR浓度和作用时间的增加而升高(表1)。根据结果，本研究选择1μmol/L的DNR处理K562/DNR细胞24 h作为后续实验的浓度和时间。

表1 不同浓度和处理时间的DNR对K562/DNR细胞凋亡的作用

2.2 IκBα△N联合柔红霉素对诱导K562/DNR细胞NF-κB活性的影响

将 K562/DNR细胞感染 Ad5F35-IκBα△N重组腺病毒后再和1μmol/L柔红霉素培养24 h，用流式细胞术分析细胞凋亡。结果显示：感染Ad5F35-IκBα△N重组腺病毒后细胞凋亡率 [(43.2±4.8)%]较感染前[(10.4±1.5)%]明显增多，差异有统计学意义(P＜0.05)(表2)。分别提取柔红霉素组、重组腺病毒+柔红霉素组细胞核蛋白，并测定其NF-κB活性。结果显示：柔红霉素组、重组腺病毒+柔红霉素组的 NF-κB活性分别为 0.224±0.021和 0.132±0.015活性单位/μg核蛋白，感染后的NF-κB活性明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)(表2)。与柔红霉素组比较，＊P＜0.05

表2 重组腺病毒感染24小时后细胞凋亡率与NF-κB活性的变化

3 讨论

白血病是我国常见的血液系统的恶性肿瘤。化疗是目前治疗白血病的主要手段之一，而化疗过程中患者对化疗药物产生多药耐药(MDR)是化疗失败和预后差的重要因素[5]。目前研究认为，白血病细胞可以通过多种途径产生多药耐药。在这些耐药机制中，NF-κB信号通路与肿瘤细胞的发生、增殖、分化、凋亡及耐药有密切关系，是多药耐药信号转导途径中的主要信号分子，在白血病细胞表达与耐药有关的因素中可能起关键的调控作用[6]。

正常状态下，NF-κB与其抑制蛋白IκBα结合而以非活性状态存在于细胞质中。当肿瘤细胞在受到化疗药物、放疗等刺激后，IκBα被其激酶即IKK复合物磷酸化。磷酸化IκBα又快速发生泛蛋白化。随后，IκBα 迅速被蛋白酶降解，而 NF-κB 则与 Iκ-Bα解离并暴露出核定位信号，从而进入细胞核，成为活化的NF-κB。NF-κB活化后，通过与其靶基因启动子或增强子DNA序列上的κB位点结合并诱导它们转录，从而抑制肿瘤的凋亡[7-8]。有研究表明肿瘤细胞对抗癌药物诱导的细胞凋亡的抗凋亡能力与NF-κB激活直接相关，抑制肿瘤细胞NF-κB活化可提高化疗的敏感性[9-10]。

TanaKa等[11]发现 IκBα第 32和 36位的丝氨酸磷酸化，第21和22位的赖氨酸泛蛋白化可引起NF-κB活化。国外实验室常用的抑制NF-κB活化的方法是将丝氨酸32/36或赖氨酸21/22位突变的IκBα转移入肿瘤细胞，达到阻断NF-κB活化的目的，或通过蛋白酶抑制剂使NF-κB活化受抑制，从而增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[12]。但Birkenkamp的研究表明IκBα第42位酪氨酸磷酸化也可引起NF-κB活化[13]。是否存在有其他部位的氨基酸磷酸化激活NF-κB还不确定。为避免有其他部位氨基酸磷酸化激活NF-κB，本实验中用Ad5F35-IκBαΔN 重组腺病毒将第 1～70位氨基酸位点发生突变的 IκBα转入 K562/DNR细胞，与NF-κB发生不可逆性结合，防止IκB被IKK复合物磷酸化，进而阻断NF-κB活化。

本研究结果显示：感染Ad5F35-IκBαΔN重组腺病毒后，DNR对K562/DNR细胞诱导凋亡作用明显增强，而NF-κB活性明显减少。由此可以表明突变型IκBα可以有效的抑制NF-κB激活，增加K562/DNR细胞的凋亡率，逆转K562/DNR对DNR的耐药性。为白血病的治疗提供一条新的依据。

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