黄芪失笑散对急性心肌梗死大鼠心功能及Caspase-8表达的影响*

2013-10-02魏丽萍陈铁龙赫小龙祝光礼

中国中医急症 2013年4期

魏丽萍陈铁龙赫小龙祝光礼

（浙江中医药大学附属广兴医院，浙江杭州 310007）

随着社会发展及生活方式的转变，心血管疾病日益增多，尤其急性心肌梗死，其发病急，致死率高，已成为严重影响我国人民健康的疾病。黄芪失笑散临床应用可以有效缓解冠心病心绞痛症状，前期研究发现其具有抗动脉粥样硬化、保护血管内皮功能及促血管新生的作用［1-3］。本研究通过观察该方对急性心肌梗死大鼠心功能及细胞凋亡相关蛋白的影响，进一步探讨其对缺血心肌保护的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物雄性SD大鼠120只，浙江省实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（浙）2008-0033，体质量180～220 g。

1.2 药物与试剂黄芪失笑散（组成：黄芪30 g，蒲黄20 g，五灵脂20 g，浓缩成2 g/mL的生药煎剂，本院制剂室提供）；Caspase-8兔多克隆抗体、一抗稀释液、HRP标记二抗（杭州达文生物有限公司）；蛋白质定量试剂盒（BCA法，北京普利莱基因技术有限公司）。

1.3 大鼠急性心梗模型的建立将120只SD大鼠随机分为5组，每组24只。模型组（灌胃灭菌蒸馏水2 mL/d），黄芪失笑散大、中、小剂量组（每日灌胃黄芪失笑散 28、14、7g/kg）、对照组（灌胃灭菌蒸馏水 2mL/d），连续灌胃7 d后进行造模。大鼠麻醉后，予气管插管及呼吸机辅助呼吸。于心尖搏动处暴露心脏并打开心包，结扎左冠状动脉前降支，心电图出现ST段明显弓背抬高提示急性心梗造模成功。后关闭胸腔，待动物恢复自主呼吸后，拔除插管，停呼吸机。对照组除不结扎冠状动脉外，其余手术过程一致。

表1 两组大鼠血流动力学指标比较（±s）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与黄芪失笑汤小剂量组比较，#P＜0.01，##P＜0.05。下同。

组别 n对照组 8模型组 8黄芪失笑汤小剂量组 8 LVSP（mmHg）LVEDP（mmHg）+dp/dtmax（mmHg/s）-dp/dtmax（mmHg/s）146.6±5.5** 6.0±1.9** 5894.1±672.2** 4839.6±239.8**76.3±24.3△△ 17.9±2.7△△ 3699.8±390.0△△ 2695.0±182.3△△100.7±5.8△△ 12.1±2.1**△△ 4003.3±515.7△△ 3122.9±164.6**△△黄芪失笑汤中剂量组 8 111.2±20.3*△ 8.4±1.3** 5052.3±536.5**△△ 4214.7±378.7**△△黄芪失笑汤大剂量组 8 123.5±23.1** 6.5±1.9** 5444.1±583.9**△△# 4498.7±499.5**△#

1.4 血流动力学检测术后4.5 h行血流动力学检测。大鼠麻醉后，分离右侧颈总动脉，三通管连接20 G静脉鞘管和压力换能器，在颈总动脉插入鞘管，通过Medlab-U/4 CS生物信号采集处理系统观察压力曲线，测量并记录每只大鼠的左室内压峰值（LVSP）、左室等容收缩末期压力上升最大速度（+dp/dtmax），左室舒张末压力（LVEDP）、左室压力下降最大速度（-dp/dtmax）等参数。

1.5 Western Blot法测定心肌Caspase-8蛋白的表达取各组大鼠左室梗死边缘区心肌组织，蛋白裂解液提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取各组样品50 μg，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜，用5％脱脂奶粉室温摇床封闭1.5 h后，加入一抗4℃孵育过夜，后脱洗3次，然后加入二抗室温下摇床孵育1.5 h，后脱洗3次。ECL发光液显色，胶片扫描后用Image J软件进行图像分析，以β-actin（1∶1000稀释）作为内参照对比，比值结果表示其蛋白的相对含量。

1.6 统计学处理应用SPSS16.0统计软件。计量资料以（±s）表示。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芪失笑散对血流动力学影响见表1。与模型组相比，黄芪失笑散大、中剂量组可明显改善LVSP、+dp/dtmax、LVEDP 和-dp/dtmax（P＜0.05 或 0.01）。与对照组比较，黄芪失笑散大剂量组在LVSP变化上无明显差异（P＞0.05）；黄芪失笑散大剂量组在改善+dp/dtmax和-dp/dtmax方面与小剂量组有明显差异（P＜0.05），且存在 LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax随黄芪失笑汤剂量的提高而升高的趋势，LVEDP随黄芪失笑汤剂量的提高而降低的趋势，说明黄芪失笑散对心梗后大鼠血流动力学改善呈剂量依赖性，其中黄芪失笑散大剂量对血流动力学各指标改善程度最高。

2.2 黄芪失笑散对Caspase－8蛋白表达的影响见表2。与对照组比，模型组Caspase-8蛋白表达明显升高（P＜0.01）。黄芪失笑散大、中剂量组与模型组相比，Caspase-8蛋白表达明显降低（P＜0.05或0.01）。黄芪失笑汤各剂量组间两两比较无统计学差异（P＞0.05），但是存在Caspase-8蛋白的表达水平随黄芪失笑汤剂量的提高而降低的趋势，说明黄芪失笑散对Caspase-8蛋白表达的调节作用呈剂量依赖性，其中大剂量组的抑制作用较强（图1）。

3 讨论

急性心肌梗死是临床常见急危重症，心肌坏死的范围与预后密切相关。目前研究表明细胞死亡有坏死和凋亡两种机制，而凋亡先于坏死发生，是梗死灶扩大的主要因子，并且存在于心肌梗死病理改变全过程［4］。因其具有可调控性，所以AMI的细胞凋亡领域成为了现代研究的热点。Caspase家族（Caspase-1～Caspase-14）参与细胞凋亡的全过程，是细胞凋亡的核心成分，其中Caspase-8是家族中细胞凋亡的启动者之一，可以在外界促细胞凋亡因子的刺激下发生酶切而变为有活性的cleaved Caspase-8（相对分子量18 kDa），从而启动Caspase级联反应，最终活化执行者Caspase-3引起细胞凋亡。

中医学并无急性心肌梗死的病名，多归于 “真心痛”或“胸痹心痛”范畴，病机多与气虚血瘀有关，故治疗以益气活血为主。黄芪失笑散以《太平惠民和剂局方》中之失笑散为基础，加用大剂量黄芪，全方共奏益气活血、散结止痛之效。而现代研究表明黄芪及失笑散均有抑制细胞凋亡的作用［5-8］。本研究显示黄芪失笑散可改善心肌梗死大鼠的心功能，下调活化的Caspase-8蛋白表达量，并呈剂量相关性，其中以大剂量组效果最好，从而进一步证实了该方抗心肌缺血的确切作用，并揭示其机制与抑制Caspase-8的活化从而减少细胞凋亡有关，为临床进一步推广应用提供了较好的理论依据。