壳聚糖对青枯劳尔氏菌生长及其生物膜形成的影响

苏 婷， 王桂跃＊， 谢关林

（1.浙江省东阳玉米研究所，东阳 322100； 2.浙江大学生物技术研究所，杭州 310029）

青枯劳尔氏菌［Ralstoniasolanacearum（Smith）Yabuuchi et al.］能引起系统侵染的毁灭性土传病害，即作物青枯病。该病原的寄主范围广泛，可侵染44个科的数百种植物［1］。壳聚糖是由甲壳素经脱乙酰化处理后的产物，具有良好的生物相容性，可生物降解且无毒副作用，广泛存在于虾、蟹等动物外壳和藻类、真菌的细胞壁中［2－3］。壳聚糖是一种抗菌谱较广的天然物质，对细菌、真菌和病毒等均有不同程度的抑制作用。早在19世纪80年代末，Kendra［4］就发现壳聚糖对镰刀菌等具有抑制效果，而经壳聚糖溶液处理过的番茄植株能有效抑制Phytophthorainfestans菌丝的生长，防止番茄早疫病的大面积发生［5］。壳聚糖种子处理后，辣椒幼苗能提高诱导抗性，预防Colletotrichumsp.的感染［6］。Li［7］等研究发现壳聚糖能抑制Pseudomonasfluorescens，防止西兰花头腐病的发生。

细菌生物膜通常是附着在固体表面的微生物群体，其主要成分包括胞外多糖、胞外蛋白以及一些核酸［8］。生物膜的存在有助于细菌抵御不良的外界环境以及有害物质的侵蚀，维持其生存环境的相对稳定，这是细菌所具有的一种非常重要的环境适应机制［9］。

本研究室已发现壳聚糖能有效防治番茄青枯病的发生，其土壤浇灌和种子处理后的防治效果分别达71.99%和48.01%［10］。本文通过检测不同浓度的壳聚糖溶液在不同时间段对青枯菌的抑菌效果，了解壳聚糖对青枯菌生长及其生物膜形成的影响，为壳聚糖控制植物青枯病提供更有利的理论依据。

1 材料与方法

1.1 壳聚糖的制备

将脱乙酰度为75%的壳聚糖粉末（购自Sigma公司）溶解于体积分数为1%的乙酸中，配制成浓度为10 mg／m L 的 壳 聚 糖 溶 液，调 p H 至 5.6［3］，121℃灭菌20 min，待用。同时将p H为5.6，体积分数为1%的乙酸溶液灭菌待用。

1.2 青枯菌菌悬液的制备

试验所用青枯菌Rs－91菌株由福建省农业科学院提供。挑取在TZC培养基上生长的青枯菌单菌落，接种于LB液体培养基中，30℃，170 r／min振荡培养24 h。

1.3 壳聚糖与菌悬液的混合培养

准备6个已灭菌离心管，每管按表1加入混合培养物，使壳聚糖终浓度分别达0.00、0.05、0.10、0.15、0.20 mg／m L和0.25 mg／m L。各取100μL加入到96孔培养板中（为减少误差，培养板的边缘孔不加培养物），每处理设10个重复。

表1 壳聚糖与菌悬液的混合培养成分Table 1 Components for mixed culture of chitosan and bacterial suspension

1.4 壳聚糖抑菌效果的检测

将1.3制备好的混合培养物在30℃条件下分别振荡培养24、48 h和72 h。用排枪将每个孔内的培养物混合均匀后，利用美国BIOTEK公司POW－ERWAVE XS全波长扫描式酶标仪测定在600 nm下的吸光值A600。抑菌率＝（对照组A600－试验组A600）／对照组A600。

1.5 生物膜形成的评价

应用结晶紫的方法［11］对青枯菌在96孔培养板表面的成膜能力进行评价。将1.3制备好的混合培养物在30℃条件下分别静置培养24、48 h和72 h，小心移去培养物后，用蒸馏水轻轻洗涤2次，然后加入100μL浓度为1%的结晶紫对残留细胞和基质进行染色，25 min后用蒸馏水清洗2次，加入150μL二甲基亚砜以溶解吸附于生物膜上的结晶紫，测定其在570 nm下的吸光值，即A570。

1.6 透射电镜观察（TEM）

在1.96 m L浓度约为108cfu／m L的细菌悬浮液中加入0.04 m L浓度为10 mg／m L的壳聚糖溶液，使壳聚糖终浓度达0.2 mg／m L。混合液在28℃恒温摇床上170 r／min振荡培养24 h，吸取1 m L混合液置于1.5 m L离心管中，4 000 g离心10 min。离心后的菌体在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定过夜。按照透射电镜要求包埋处理后，在Reichert超薄切片机中切片，获得70～90 nm的切片，该切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色15 min，即可在日本JEOL公司的JEM－1230型透射电镜中观察。同时设置无壳聚糖处理的菌悬液为对照。

2 结果与分析

2.1 壳聚糖对青枯菌生长的抑制效果

结果显示混合培养24 h后，当壳聚糖终浓度在0.10 mg／mL和0.15 mg／mL时，两者的A600和抑菌率存在显著差异，而壳聚糖终浓度为0.15、0.20 mg／m L和0.25 mg／m L时，三者的A600和抑菌率在同一水平上（表2）。混合培养48 h和72 h后，当壳聚糖终浓度超过0.15 mg／m L后，其对青枯菌的抑制效果处于同一水平。

混合培养48 h后，对照组的A600高达0.629，表明此时青枯菌生长旺盛，但经壳聚糖处理后，其抑菌率均高于相同壳聚糖浓度的其他时间段，最高抑菌率达74.3%。说明在生长48 h时，青枯菌虽生长旺盛，但对外界环境因素的作用敏感，壳聚糖对其抑制效果最显著。

表2 壳聚糖对青枯菌生长的抑制效果1）Table 2 Inhibitory effect of chitosan on the growth of Ralstonia solanacearum

2.2 壳聚糖对青枯菌生物膜形成的影响

结果显示在培养24 h后，青枯菌生物膜形成能力较弱，壳聚糖对其未产生显著影响，而对照组青枯菌生物膜形成量在培养48 h后达最大值，A570为0.202，随着壳聚糖浓度的增加，青枯菌生物膜形成量越低，说明此时壳聚糖对其有一定的抑制作用（图1）。但培养72 h后，青枯菌生物膜形成量反而降低，在无壳聚糖的条件下，其生物膜A570仅为0.151，而壳聚糖浓度的增加并未对青枯菌生物膜的形成量产生显著影响。

2.3 壳聚糖处理青枯菌的透射电镜观察

未经壳聚糖处理的青枯菌在电镜下，细胞形态完整，细胞膜清晰，边界明显（图2a）。壳聚糖处理24 h后，青枯菌的细胞膜出现破损，并且被一层带状的物质所包裹，细胞质膜逐渐与细胞外膜分离，在细胞内部形成空泡，且细胞的形态变得不规则（图2b）。

图1 壳聚糖对青枯菌生物膜形成的影响Fig.1 Effect of chitosan on biofilm formation of R.solanacearum

图2 青枯菌不处理对照（a）和0.2 mg／mL壳聚糖处理（b）在透射电镜下的细胞形态Fig.2 Cellular morphology of R.solanacearum untreated（a，CK）and treated with 0.2 mg／m L chitosan（b）observed by transmission electron microscopy（TEM）

3 讨论

大量研究表明，壳聚糖不仅能诱导植物增强自身防御反应，产生广谱抗性，还能直接作用于病原微生物而抑制多种植物病原菌的生长［4－7］。而目前国内外报道多是用平板对峙法等检测壳聚糖抑制植物病原细菌的生长［10］，特别是菌落计数法可能存在较大误差，而且操作繁琐，不利于大批量样本的检测。本文用酶标仪直接测定混合液体培养基的吸光值对青枯菌生长情况进行定量分析，结果显示0.15 mg／m L的壳聚糖浓度能有效抑制青枯菌的生长，而在培养48 h时，其抑菌率最高达74.3%。

青枯劳尔氏菌的主要致病因子是胞外蛋白和胞外多聚糖［12］，这些物质正是生物膜的主要组成部分。而周智等［13］研究已发现在离体条件下壳聚糖处理后菌斑生物膜的形成能力受阻，可见壳聚糖对某些细菌的生物膜形成有抑制作用。作者检测了不同浓度壳聚糖在不同时间段对青枯菌生物膜形成的影响，结果显示随着壳聚糖浓度的增加，青枯菌生物膜形成量有不同程度的降低，尤其在48 h时，其生物膜形成量逐渐降低，但未产生显著差异。

壳聚糖能够破坏一些细菌的外膜，如大肠杆菌、克雷柏氏杆菌、葡萄球菌等［14－15］，但对有些细菌膜的破坏并不剧烈［16］。通过壳聚糖处理青枯菌的透射电镜观察，我们认为壳聚糖通过破坏青枯菌的细胞膜，改变细胞膜的通透性，引起细胞内外渗透压的失常从而抑制了细菌的生长。

壳聚糖作为一种良好的生物源农药，具有无毒、无污染和生物相容性等优良特性，且在实际应用中施用方式简单，使用安全，能和多种杀菌剂混合使用［2－3］，这些优良特性决定了壳聚糖在防治植物病害方面将具有广阔的应用前景。但壳聚糖对植物病原菌抑菌反应的机理十分复杂，随着基因工程等技术的发展，相信壳聚糖的抑菌机理将愈来愈清楚。

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