一株具有诱导抗性木霉菌株的筛选及其对黄瓜灰霉病诱导抗性的初步研究

黄亚丽， 王淑霞， 杜晓哲， 张丽萍＊

（1.河北省科学院生物研究所，主要农作物病害微生物控制工程技术研究中心，石家庄 050081；2.河北师范大学生命科学学院，石家庄 050016）

化学农药的长期使用带来的种种弊端，如有害生物抗药性的产生、残留毒性及环境污染等已成为危及生态平衡、人类健康和社会发展的重要因素。随着人类对农业生态的关注及对环境问题认识的深化，开发高效低毒生防制剂的呼声日益高涨。利用微生物诱导植物产生系统抗性进行植物病害的生物防治是生防制剂开发的新切入点，研究发现利用微生物诱导植物产生抗病性具有抗病谱广、持续时间较长、可控的抗病性表达时间和空间且大部分诱导物对环境无污染等特点［1－3］，这些特点决定了微生物诱导植物抗病性具有良好的应用前景。

木霉是一种能够诱导植物产生系统抗病性的生物因子［4］，Bigirimana等人首次证明了木霉具有诱导植物产生系统抗性的能力［5－6］，随后的研究发现绿色木霉、棘胞木霉、深绿木霉、哈茨木霉等均可诱导植物获得对广谱性致病真菌、细菌、病毒等微生物的局部或系统抗性［4］，对具有诱导植物产生系统抗性的木霉菌株进行筛选及研究可为新型生防制剂的开发提供重要的材料。

Tr－92是由本课题组自植物根部土壤中分离出的一株拮抗木霉，对灰霉病菌、立枯丝核菌、镰刀菌等十余种病原菌均具有拮抗作用。本研究通过对该菌与灰霉病菌在黄瓜的不同部位施用，发现该菌具有诱导黄瓜产生对灰霉病菌系统抗性的能力，能够增加诱导抗性相关酶活的表达量。该研究的进行为优化生防木霉的利用方式和提高其施用效果提供优质的菌种资源和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

木霉菌株为本实验室自植物根部土壤中分离保存；灰霉病菌为本实验室从温室黄瓜病株上分离保存。

1.1.2 植物材料

黄瓜‘冀杂1号’。

1.1.3 培养基

PDB液体培养基：200g去皮土豆切块煮沸30min，4层纱布过滤后用蒸馏水补足1 000mL，加入葡萄糖20g。PDA固体培养基：为PDB液体培养基加入琼脂15g。

1.2 诱导黄瓜产生系统抗性的木霉菌株的筛选

1.2.1 木霉和灰霉病菌的培养及菌悬液的制备

将试管保存的木霉菌种接种到PDA平板，30℃恒温培养5d，用无菌水冲洗木霉平板得到木霉孢子悬液，用血球计数板计数并调整其浓度为106cfu／mL；将保存的灰霉病菌接种到PDA平板，24℃恒温培养7～10d使用。

1.2.2 黄瓜的种植及诱导处理

挑选籽粒饱满的黄瓜种子用无菌水冲洗3次，经55℃恒温水浴浸泡15min后用湿润纱布包好放在培养皿中30℃催芽，待大部分种子出芽后挑取出芽情况一致的种子播种于装有灭菌蛭石的直径10cm的塑料花盆中，每盆2粒种子，于20～24℃培养室（光照黑暗周期为16h：8h）进行培养，黄瓜幼苗长出5片真叶后，进行诱导处理。

试验共3个处理：分别为清水对照（CK）、挑战接种处理（只接种灰霉病原菌，H）、诱导处理（接种木霉和灰霉病菌，Tr－92＋H），每个处理30次重复。具体的处理方法为：用无菌注射器将5mL木霉孢子悬浮液注入诱导处理的黄瓜植株根部土壤中，向另外两个处理中加入等量无菌水。木霉诱导接种24h后，打取直径5mm的灰霉病菌菌块倒扣接种到挑战处理和诱导处理的黄瓜苗叶片上，每个真叶上接种1个菌块，每株接种3片真叶，接种后保湿培养24h（湿度≥90%）。

待挑战接种处理组叶面普遍发病后记录并统计病情指数，计算防病效果。计算公式如下：

病情指数＝∑（各级病叶数×病级数）／

（调查总叶数×最高病级数）×100；

防病效果（%）＝（对照病情指数－处理病情指数）／

对照病情指数×100。

1.3 诱导抗性木霉菌株的鉴定

1.3.1 菌落形态特征观察

根据《真菌鉴定手册》、《木霉分类与鉴定》等方法［7－9］，采用PDA培养基培养真菌，肉眼观察菌落生长特征、测量菌落生长速度，光学显微镜下观察菌丝形状及是否有横隔、孢子大小、形状、类型等，扫描电镜观察分生孢子，对照确定菌株的种属地位。

1.3.2 18SrDNA鉴定

将筛选菌株的孢子液接入PDB液体培养基中，28℃摇床培养48h，过滤获得菌丝，提取真菌基因组DNA［10－11］。以提取的真菌 DNA 作为模板，以NS1（5′－GTAGTCATATGCTTGTCTC－3′）和 NS8（5′－TCCGCAGGTTCACCTACGGA－3′）引 物 对 进行PCR扩增。PCR反应体系为25μL，反应体系为：基因组DNA 1μL，10×PCR buffer 2.5μL，NS1引物1μL，NS8引物1μL，dNTPs 2μL，Taq 酶0.25μL，ddH2O 17.25μL。反应条件为：94 ℃5min，94℃ 30s，57 ℃ 50s，72 ℃ 50s；循环30次；72℃10min。PCR扩增产物送上海生工生物技术有限公司测序后，将获得的DNA序列，输入Gen－Bank，用Blast程序与数据库中的所有序列进行比较分析。利用MEGA4.1进行系统发育树的构建。

1.4 Tr－92菌株诱导处理黄瓜幼苗根部对黄瓜叶片中系统抗性相关酶活的影响

试验处理如1.2，诱导接种木霉后第0h、24h、48h、72h、96h和120h采集倒第3片黄瓜叶片剪碎，进 行 过 氧 化 物 酶 （POD）［12］、多 酚 氧 化 酶（PPO）［13］、苯丙氨酸解氨酶（PAL）［14］、β－1，3葡聚糖酶［15］、几丁质酶（CHI）［16］的测定。

2 结果

2.1 诱导抗性木霉菌株的筛选

将12株具有拮抗能力的木霉菌株诱导接种到黄瓜幼苗根部，待对照发病后统计不同处理的病情指数。试验结果表明，与只接种灰霉病菌的挑战处理相比，接种菌株Tr－92的诱导处理病情指数极显著低于挑战处理，防病效果达56.0%。由于木霉与病原菌接种于不同的部位，说明该菌株具有较强的诱导黄瓜产生抗灰霉病的能力。

表1 木霉诱导对黄瓜幼苗病情指数的影响1）Table 1 Effects of Trichodermainduction on the disease index of cucumber seedlings

2.2 Tr－92菌株的形态学鉴定

对菌株Tr－92进行平板培养及载片培养，平板培养观察其菌落形态，载片培养在光学显微镜下进行菌丝和孢子形态的观察，并将木霉孢子进行电镜观察，结果见图1a、b、c、d。

图1 木霉Tr－92的形态Fig.1 Morphology of Trichoderma Tr－92

将5mm Tr－92菌株的菌丝块接种到PDA上，28℃恒温培养24h后肉眼可看到清晰的菌丝体，菌落扩展较快，培养72h菌落直径为80mm，菌丝层较厚，致密绒状，菌落初期为白色，后期因产生孢子而呈绿色。菌落背面初为无色，后期成黄褐色（图1）。

在显微镜下观察，菌丝透明，有隔，内含物丰富，细胞壁光滑，菌丝生长端呈椭圆形。分生孢子梗由菌丝直立生出，无色，对生二至三级分枝，分枝与分生孢子梗近似直角，小梗瓶形，瓶体端部尖削，微弯，尖端生分生孢子。分生孢子椭圆形，一端略尖，孢子长直径4.5～5.5μm，短直径3～4μm，表面光滑。根据《中国真菌志》等，菌株Tr－92依形态学特征初步鉴定为木霉属（Trichoderma）。

2.3 Tr－92菌株的分子生物学鉴定

以Tr－92菌株的总DNA为模板利用NS1、NS8引物对进行扩增，PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，得到一条明亮特异条带，长约1 800bp，与18S rDNA序列大小一致。上述结果表明：成功扩增了Tr－92菌株的18SrDNA核酸片段。获得的Tr－92菌株18SrDNA核酸序列（GenBank登录号为：BankIt1533635 Trichoderma JX029044）。经比对发现：Tr－92菌株与哈茨木霉（Trichoderma harzianum）的18SrDNA核酸序列相似性最高，为99%；根据18S rDNA序列对Tr－92及相近物种进行聚类分析，结果表明Tr－92 18SrDNA序列与哈茨木霉的序列同源性最近。因此，鉴定Tr－92菌株为哈茨木霉。

根据Tr－92的18SrDNA序列分析，结合其分生孢子梗、分生孢子及菌丝形态特征，将其鉴定为 哈茨木霉。

图2 菌株Tr－92的基于18SrDNA序列同源性构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree constructed using 18SrDNA sequences

2.4 诱导接种Tr－92菌株对黄瓜叶片中诱导抗性相关酶活性的影响

大量研究表明，植物诱导抗性的产生是通过防御酶系活动而实现的，所以本研究测定了利用Tr－92菌株诱导处理后黄瓜幼苗叶片中过氧化物酶、多酚氧化酶、β－1，3葡聚糖酶、苯丙氨酸解氨酶、几丁质酶的活性（图3）。由图4可以看出，木霉Tr－92菌株接种能够诱导黄瓜叶片中过氧化物酶、多酚氧化酶、β－1，3葡聚糖酶、苯丙氨酸解氨酶、几丁质酶的产生，诱导处理24h后测定各处理防御酶活性发现，接种木霉Tr－92菌株的诱导处理各酶活性均高于对照，这种活性增高一直持续整个测定时期（诱导处理120h后），诱导处理过氧化物酶、多酚氧化酶、丙氨酸解氨酶、几丁质酶、β－1，3葡聚糖酶活性的峰值分别是对照处理的3.61、1.44、3.94、1.34、1.39倍。试验结果表明，防御酶系活动增强是木霉诱导黄瓜产生抗灰霉病系统抗性的机制之一。

图3 菌株Tr－92对黄瓜叶片中防御酶活性的影响Fig.3 Effects of the strain Tr－92on the activity of resistance enzymes in cucumber leaves

3 讨论

植物诱导抗病性是调动植物内在抗性机制的一种新的病害防治对策，是植物受到激发子诱导后，调动体内防御系统抵御病原物的侵染，使植物免受或减轻病原菌危害的一种现象。具有新型、广谱、高效、多功能、无残留等优势，在植物病害防治中具有突出的优势。

木霉是一种可以激发植物诱导抗病性的生防因子，诱导宿主植物产生一系列局部或系统防御反应［4］。张婷 研 究 发 现，木 霉 菌 株 H6、D9、C40、SH2303包衣种子可以诱导玉米产生抗弯孢叶斑病的效果，在温室条件对弯孢叶斑病的防效分别为20.69%、53.77%、72.74%、37.52%［17］。本研究通过生测试验，从实验室保存的拮抗木霉菌株中筛选到一株具有诱导黄瓜产生灰霉病抗性的菌株Tr－92，与挑战接种处理相比其诱导防病效果为56.0%。说明该拮抗木霉菌株除了具有直接拮抗病原菌的效果外，还能够通过激发黄瓜自身的防御系统达到防病的效果。对该菌进行了形态学和分子生物学鉴定，该菌株为哈茨木霉，该种是一种常见木霉拮抗种，已经在生防方面有一些报道。该研究的进行可以为木霉在生物防治上的应用提供新的菌株，特别是对于叶面病害的防治来讲，利用诱导抗性木霉在根部接种就可有效防治，从而降低了环境因素：如紫外线、降雨等对木霉在叶面定殖的不良影响。

植物诱导抗性的产生是通过防御酶系活动而实现的，研究表明植物系统抗性反应与植物自身的苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、脂氢过氧化物裂解酶、过氧化物酶、几丁质酶、β－1，3－葡聚糖酶等活性增加关系密切［18－19］。徐韶等研究发现内生枯草芽胞杆菌B6和木霉T23复合接种能够诱导甜瓜根系苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶、多酚氧化酶和β－1，3－葡聚糖酶活性不同程度的提高［20］。本试验利用木霉Tr－92孢子悬浮液在黄瓜幼苗根部灌施，分析比较了黄瓜叶片防御反应酶系苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶和过氧化物酶、几丁质酶和β－1，3－葡聚糖酶活性的变化趋势。结果表明：木霉Tr－92能够诱导黄瓜叶片中PAL、PPO、POD等酶活性不同程度的提高，从接种之后到120h，诱导处理中黄瓜叶片防御酶活性都显著高于挑战接种处理和清水对照，说明接种木霉Tr－92有利于防御反应酶基因的表达，这与徐韶等研究结果相类似。

由于本研究采用的是木霉与灰霉病菌不同位点接种，通过木霉黄瓜幼苗根部接种后，可以增加黄瓜叶部抗性相关酶活性的表达量、降低叶部病害的病情指数；另外试验过程中对叶部进行了真菌分离，发现叶部没有木霉定殖，说明黄瓜中系统抗性相关酶活及叶部病害病情指数的变化是由于木霉诱导产生的结果，表明诱导抗性是木霉Tr－92生防机制中的一个重要方面，可在植物病害综合防治中发挥重要作用，为植物病害生物防治提供了一种新思路。

［1］ 杜建玲.植物诱导抗性理论及其应用前景［J］.北京林业大学学报，1994，16（2）：83－88.

［2］ 翁启勇，李开本.诱导植物系统抗性研究及进展［J］.福建农业学报，1998，13（4）：23－28.

［3］ 刘晓光，高克祥，康振生.生防菌诱导植物系统抗性及其生化和细胞学机制［J］.应用生态学报，2007，18（8）：1861－1868.

［4］ Harman G E，Howell C R，Viterbo A，et al.Trichoderma species opportunistic avirulent plant symbionts［J］.Nature，2004，2：43－56.

［5］ Bigirimana J，De Meyer G，Poppe J，et al.Induction of systemic resistance on bean（Phaseolus vulgaris）by Trichoderma harzianum［R］.Mededelingen van de Faculteit Landbouwkundige en Toegepaste Biologische Wetenschappen，Universiteit Gent，1997，62：1001－1007.

［6］ Geert De Meyer1，Joseph Bigirimana1，Yigal Elad，etc.Induced systemic resistance in Trichoderma harzianumT39biocontrol of Botrytis cinerea［J］.European Journal of Plant Pathology，104：279－286，1998.

［7］ 魏景超.真菌鉴定手册［M］.上海：上海科学技术出版社，1979.

［8］ 杨合同.木霉分类与鉴定［M］.北京：中国大地出版社，2009：1－150.

［9］ 章初龙，徐同.我国河北、浙江、云南及西藏木霉种记述［J］.菌物学报，2005，24（2）：184－192.

［10］ 吴志红，汪天虹，黄卫，等.简便易行的丝状真菌染色体DNA提取法［J］.菌物系统，2001，20（4）：575－577.

［11］ 甄静，王继雯，谢宝恩，等.一株纤维素降解真菌的筛选、鉴定及酶学性质分析［J］.微生物学通报，2011，38（5）：709－714.

［12］ 陈捷，高增贵，郭红莲，等.玉米弯孢叶斑病菌毒素对寄主防御酶系活性的影响及诱导抗性效应［J］.植物病理学报，2002，32（1）：43－48.

［13］ 李靖，利容千，袁文静.黄瓜感染霜霉病菌叶片中一些酶活性的变化［J］.植物病理学报，1991，21（4）：277－233.

［14］ 杜立新，冯书亮，王容燕，等.拮抗BS－208菌株对番茄灰霉病诱导抗性的初步研究［J］.华北农学报，2005，20（6）：84－87.

［15］ 高增贵.玉米内生细菌种群多样性与纹枯病生防机理的研究［D］.沈阳：沈阳农业大学，2003.

［16］ 曹建康，姜微波，赵玉梅.果蔬采后生理生化实验指导［M］.北京：中国轻工业出版社，2001.

［17］张婷，朱洁伟，陈捷，等.拮抗木霉菌对玉米弯孢叶斑病的诱导抗性作用［J］.上海交通大学学报，2011，29（4）：38－42.

［18］ Shoresh M，Harman G E.The molecular basis of shoot responses of maize seedlings to Trichoderma harzianumT22inoculation of the root：aproteomic approach［J］.Plant Physiology，2008，147（4）：2147－2163.

［19］ Segarca G，Casanova E，Bellido D.Proteome，salicaylic acid，and jasmonic acid changes in cucumber plants inoculated with Trichoderma asperellumstrain T34［J］.Proteomics，2007，7（21）：3943－3952.

［20］ 徐韶，庄敬华，高增贵，等.内生细菌与木霉复合处理诱导甜瓜对枯萎病的抗性［J］.中国生物防治，2005，21（4）：254－259.