潞党参四倍体优良植株的诱导及鉴定

李香串，张海弢

(1.山西省医药与生命科学研究院，山西 太原 030006；2.吉林农业 大学中药材学院，吉林 长春 130118)

潞党参四倍体优良植株的诱导及鉴定

李香串1*，张海弢2

(1.山西省医药与生命科学研究院，山西 太原 030006；2.吉林农业 大学中药材学院，吉林 长春 130118)

目的：选育潞党参新品种，解决生产中产量低和抗逆性差的问题。方法：以秋水仙碱为诱变剂诱导多倍体，结合组织培养技术，快速有效的繁育出大量的用于选育优良党参的原始材料，通过倍性稳定性观察和田间选育，选出优良株系。结果：制染色体观察片时，最佳解离条件为使用药剂HCl∶45%醋酸(2∶1)，解离20～30 s；最佳染色方法是将0.02%浓度的秋水仙碱添加到无菌培养基中，然后把党参种子播种该培养基上诱变；在年生长期内，月份不同，制作染色体观察片的最佳取材时间不同；鉴定植株是否为四倍体时，采用直接鉴定和间接鉴定相结合技术，既保证鉴定的准确性，又可以减少工作量。结论：四倍体技术在选育倍性稳定、性状优良的潞党参优良株系过程中起到关键性的作用。

党参；四倍体；秋水仙碱浓度；鉴定

党参为桔梗科植物党参Codonopsispilosula(Franch.)Nannf.、素花党参CodonopsispilosulaNannf. var.modesta(Nannf.)L.T.Shen或川党参CodonopsistangshenOliv.的干燥根[1]。在我国，党参较之人参其药源分布广、产量大，近年来临床上多以党参替代日益昂贵的人参，作用平和，且需求呈上升趋势[2]。山西为党参的地道产区之一[3]，栽培历史悠久，所产“潞党”品质上乘，但产量较低，病虫害较多。针对生产中存在的问题，开展了潞党参多倍体育种工作，利用四倍体植株巨型性及抗逆性强的特点，在保证质量的前提下，提高产量。

在现代农业、渔业、林业分别对一些农作物、水产品和果树等成功进行多倍体育种研究应用[4-5]并获得巨大效益的现实情况下，党参生产也应加速步入多倍体栽培育种研究等科学生产途径。秋水仙碱是诱导植株多倍体常用的诱变剂，但常规的生长点涂抹法、种子或根系浸泡法，在诱变过程中容易产生嵌合体，成功率较低[6]。为此我们对常规的方法进行了创新，结合植物组织培养技术，快速有效地获得大量四倍体原始材料，又经过倍性观察、田间选育，历时十多年成功选育出了倍性稳定、性状优良的潞党参株系，研究成果于2011年7月21日通过鉴定，达到同类研究的国际先进水平。其中的关键性技术，对于其它药用植物品种快速有效地获得多倍体种质资源具有借鉴作用。

1 材料和方法

1.1种子来源及处理方法

采集党参Codonopsispilosula(Franch.)Nannf.成熟的种子，选粒大饱满的用清水洗净后，再用饱和漂白粉水溶液消毒30 min，无菌水冲洗4次，在无菌条件下接种在附加蔗糖30 g·L-1，水解乳蛋白500 g·L-1，琼脂0.75 g·L-1，pH5.8，并分别添加0.0%(对照)、0.1%、0.02%、0.004%及0.008%浓度的秋水仙碱，分别编为处理1～5。其中，对照组接种800粒，药物组共接种1 560粒。

1.2根尖细胞染色体观察片的制备

1.2.1解离技术 在试管苗移栽时，将幼嫩根尖剪下，先置0.002 mol·L-18-羟基喹啉预处理1.5～2 h，在0 ℃的条件下用卡诺氏固定液(酒精与冰醋酸比例为3∶1)固定24 h，方法一：使用1 mol·L-1HCl解离，置58～60 ℃水浴锅中解离，分别解离5，6，7，8，9，10 min，然后用45%醋酸洋红染色2 h左右；方法二：在60 ℃的条件下用2份1 mol·L-1HCl和1份45%醋酸混合液解离5，12，20，30，40 s，然后用苏木精染色2 h左右；最后压片，在显微镜下(1 000×)观察并照像。

1.2.2 取材时间 从早晨7:00开始到10:00，每30 min取材观察一次；剪下根尖幼嫩的小白尖、根冠约0.3 cm～0.5 cm，花蕾取绿豆大小样子，用固定液把材料固定在小瓶中，置于冰箱中冷藏，逐一镜检筛选。根据镜检的情况再进行复筛，改为7:30到9:30，每间隔5 min取材一次，用固定液把材料固定在小瓶中，置于冰箱中冷藏，逐一镜检筛选，观察细胞分裂相。

1.3根尖细胞染色体检查

用方法二处理幼苗的根尖，解离时间20～30 s，在显微镜下(1 000×)观察根尖细胞染色体并照像。

1.4花粉母细胞染色体检查

把经过根尖染色体观察的药物组4株植株移入大田，与花期进行花粉母细胞染色体检查，取绿豆大小的花蕾作为形态指标，在0 ℃卡诺氏固定液中固定，2 h后，取其中一个花药，置于载玻片上，滴上配好的醋酸洋红染液，用尖镊子挤压后去其花药的残壁，加上盖玻片，用酒精灯微烤1～3下，轻轻压片，镜检观察并照像。

2 结果与分析

2.1不同秋水仙碱浓度对种子发芽率的影响

种子在培养基中，10 d后开始发芽，药物组的种子与对照组相比发芽势基本相同，但药物组种子发芽后生长极为缓慢，且部分变成褐色，一月后逐渐死亡，而对照组的种子发出的芽又细又高，其结果见表1。

表1 秋水仙碱对种子发芽率的影响

药物组的种子的发芽率35.2%远低于对照组72.3%的发芽率，说明秋水仙碱严重抑制种子的发芽。而且药物组种子发的芽外观形态与秋水仙碱浓度的高低有关系，高浓度培养基上发出的芽粗而短。

2.2不同秋水仙碱浓度对四倍体植株获得的影响

将成熟饱满的党参种子播种于含有一定浓度的秋水仙碱的培养基中发芽，1月后取幼嫩胚轴进行愈伤组织的培养，继代培养后，经过脱分化和再分化诱导出再生植株，经过细胞学鉴定和形态观察研究，筛查出四倍体植株20株，其结果见表2。

表2 秋水仙碱浓度对四倍体植株获得的影响

从表2可以看出：来源于处理3的胚轴再生植株，其四倍体植株较多；结合观察6批愈伤组织的继代培养，愈伤组织的颜色、质地、生长速度和诱导率以及分化情况，使用秋水仙碱诱导党参四倍体时，其浓度以0.02%为最好。

2.3不同解离方法对染色体观察片制作的影响

在染色体倍性鉴定时，制作好的染色体观察片是至关重要的，而植物材料的解离技术又是观察片制作过程的关键技术之一。不同的植物种类，不同的组织类型和材料大小不同，所需水解时间也有差别，水解时间正确，染色体着色较深，细胞质不显示任何颜色；水解时间太短，染色体着色浅淡，细胞质显出扩散的颜色，这都给观察带来不便，解离所使用的药剂和最佳解离时间为关键，对此进行了试验筛选，其结果见表3和表4。

表3 方法一

由表3可知：①解离时间短(5～7 min)时，材料发硬，在放盖玻片后材料散不开；解离时间长(9～10 min)时，材料又过软，细胞壁已破裂，染色体数不完整；只有在解离时间为8 min时，细胞壁完整，染色体分布均匀，易于观察。②此方法适宜制作临时观察片。

表4 方法二

由表4可知：解离时间短(5 s～10 s)时，材料发硬，在放盖玻片后材料散不开；解离时间长(40 s)时，材料又过软，细胞壁已破裂，染色体数不完整；只有在解离时间为20 s～30 s时，细胞壁完整，染色体分布均匀，易于观察。

与方法一比较，方法二具有解离时间短，着色深、不会因为时间长而褪色；此方法更适宜制作永久观察片。结果证明方法二，解离时间短，细胞形态完整，易于观察技术，易于压片；而且制出的压片保存的时间较长。

2.4不同月份的最佳取材时间

再生植株经过炼苗移栽到田间后，在年生长周期内观察染色体时，取材时间是关键，以能观察到染色体的分裂相为依据，根据镜检时是否能观察到细胞分裂相为依据，确定了党参在年生长周期内，不同生长月份其细胞观察的最佳取材时间，其结果见表5。

表5 不同月份的最佳取材时间

由表5可知：在年生长周期内，月份不同，党参植株处于不同的生长阶段，做镜检时取材时间应有所不同。为了制作出含有细胞分裂相的染色体观察片，应根据表4选择最佳时间取材。

2.5 间接鉴定和直接鉴定

2.5.1间接鉴定 间接鉴定的方法简单易行，而且可靠性也很大，植物变成多倍体后，整个植株呈现巨大型，茎变粗短，叶片变厚，花朵果实和种子变大，结实率低，同时气孔保卫细胞变大、密度小，保卫细胞内叶绿体变多，花粉粒变大，无效花粉增多，生育期延长，这些特征可以作为判断多倍体的根据。本文对党参的植物外观形态，气孔的形态、数量，叶片的大小及颜色，花蕾大小及花朵数进行比较，其结果见图1a～e。

2.5.1.1从试管移栽到盆内炼苗的四倍体和二倍体的植株，二者比较四倍体植株的叶子较大、颜色较深，茎也较二倍体的略粗。

2.5.1.2显微观察四倍体植株叶片的气孔明显大于二倍体，而且气孔大小统计处理差异极为显著[7]；观察的每视野中，四倍体植株的气孔数明显少于二倍体。

2.5.1.3试管小苗移入花盆后，生长1-2月后，四倍体与二倍体植株的性状差异逐渐明显，党参四倍体植株叶片的色泽较二倍体绿深，叶脉较二倍体粗且明显。

2.5.1.4四倍体花蕾及花朵明显较二倍体的大，观察还发现四倍体的植株花朵数略少于二倍体，花期略长。

2.5.2直接鉴定 通过检查花粉母细胞或根尖细胞内的染色体是否加倍加以判断，这是最可靠的根据；

2.5.2.1根尖细胞内的染色体：检查了药物组的植株4株，均为四倍体，即2n=4x=32；对照组检查5株，均为二倍体，即2n=2x=16(图1 f、g)(每株观察50个以上中期染色体)。检查了药物组的植株4株，均为四倍体，即2n=4x=32；对照组检查5株，均为二倍体，即2n=2x=16(图7)(每株观察50个以上中期染色体)。

2.5.2.2花粉母细胞染色体检查： 观察到的花粉母细胞的减数分裂两个不同时期，即后期Ⅰ和后期Ⅱ，小孢子染色体数目均为16(图h、i)，此观察与原根尖鉴定结果是一致的。

图1 四倍体与二倍体的比较

3 讨论

3.1本文采用的新方法是将党参种子接种在含有0.02%秋水仙碱培养基上发芽，药剂浓度恒定，不受外界环境和植株细胞分裂周期高峰的，在自然状态下，使药液浸入细胞的时间、浓度与其细胞分裂周期高峰的时间达到最佳的吻合点，使党参种子在发芽过程中逐渐诱变加倍，多倍体诱导成功率高。在秋水仙碱诱变多倍体时，必须同时研究药剂浓度、处理时间、细胞分裂时期和植物的生长状况四个方面因素，才能获得多倍体，而且处理时所采用的适宜的浓度和适当的处理时间是关键，处理时间愈早，获得全株为四倍体细胞的数目就愈多，处理时间愈迟，所得的结果则大多是混杂的。本诱变新方法，使种子在发芽过程中逐渐诱变加倍，有效的解决了处理时间的问题。这种新的诱变方法，具有操作简单、诱变率高、四倍体纯度高、可重复等优点。

3.2为了制作出好的党参染色体观察片，最佳方法为：将幼嫩根尖先置0.002 mol·L-18-羟基喹啉预处理1.5～2h，在0℃的条件下用卡诺氏固定液(酒精与冰醋酸比例为3∶1)固定24 h，并在60℃的条件下用2份1 mol·L-1HCl和1份45%醋酸混合液解离20～30s后压片、照相。减数分裂过程中，第一次分裂以计数和观察单个染色体的形态和行为为主，一般需要重压，而第二次分裂则需要保持细胞完整性，一般需要轻压。

3.3四倍体鉴定方法的研究，本方法是先间接鉴定，对初步判断为多倍体的植株再进行直接鉴定，具有保证鉴定质量同时，减少工作量。四倍体植物形态上与二倍体比较有明显差别，如根、茎生长速度略慢，但较二倍体粗壮；叶色深绿、叶形宽短；花朵数略少于二倍体，花期略长等特点；且生长时间越长，上述差异越明显。间接鉴定说明符合多倍体的生长发育规律和多倍体的判断标准。判断某个体是否同源多倍体，可以首先检查它的气孔和保卫细胞是否比二倍体的大，单位面积内的气孔数是否比二倍体的少，而党参四倍体测得结果表明，观察视野内气孔数目少，平均气孔大，符合多倍体的生长发育规律和多倍体的判断标准。用秋水仙碱加倍的同源四倍体已被证明其性细胞、体细胞倍性是稳定的，所以采用各株四倍体进行增殖，为选用优质党参提供了珍贵的原始材料，有可能选出新的品种后，生产应用上将有很大的潜力。

[1] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：264.

[2] 陈素萍.党参多倍体植株二代的形态及细胞学观察[J].科技情报开发与经济，2010，20(34)：177-178.

[3] 刘德军，路涛.党参[M].北京：中国中医药出版社，2001.

[4] 彭静，魏岳荣，熊兴华.植物多倍体育种研究进展[J].中国农学通报，2010，26(11)：45-49.

[5] 聂振朋，温明霞，徐建国，等.果树多倍体育种研究进展[J].现代农业科技，2007，(23)：17-18.

[6] 上海市农科院园艺所.育种探索[M].上海：上海科学技术出版社，1978.

[7] 陈素萍，王莉，宋秀清.党参多倍体育种研究[J].中草药，1991，22(5)：224-227.

更正

发表在《中国现代中药》2013年第15卷第4期的《国产西洋参生产及商品规格质量的调查分析》一文的表3中，一等品西洋参总皂苷含量55%实属笔误(见327页)，应为5.5%。特此更正。

作者 周海燕

2013年5月1日

InductionandIdentificationofTetraploidCodonopsispilosula(Franch.)Nannf.

LI Xiang-chuan1*，ZHANG Hai-tao2

InstituteofMedicineandLifeSciencesofShanxiProvince，Taiyuan，030006,China; 2.CollegeofChineseMedicinalMaterial，JilinAgriculturalUniversity，JilinChangchun130118，China)

Objective：To explore the method for induction and identification of tetraploidCodonopsispilosula，therefore setting up the basis on the breeding of new cultivars with high-quality and high resistance to biotic or abiotic stress.Methods：Seeds ofC.pilosulawere treated with colchicine.After germination，hypocotyls were selected for culture，and then the regenerated plants were screened by counting the number of chromosomes to find tetraploid strains.Results：The optimal concentration of colchicine for induction is 0.02%； the optimal solution for dissociation of cells in root ti Pis a mixture of hydrochloric acid and acetic acid(45%)with a radio of 2∶1，and the optimal dissociation time is 20-30 s； the optimal sampling time for chromosome counting in a day depends on the month for sample collection； combination of direct and indirect identification technologies can ensure the accuracy of identification and reduce the redundancy of task.Conclusion：The technologies for induction and identification of tetraploidC.pilosulawill play a key role in breeding of new cultivars with ploidy stability and high-quality.

Codonopsispilosula；tetraploidy；colchicine；identification

2012-11-27)

*

李香串，Tel:(0351)7241446， E-mail: lxch629@163.com