欧洲花楸细胞悬浮培养生长动力学研究△

肖文娟，杨光，郭兰萍，郝庆秀，林淑芳

(中国中医科学院 中药研究所，北京 100700)

中药农业

欧洲花楸细胞悬浮培养生长动力学研究△

肖文娟，杨光，郭兰萍*，郝庆秀，林淑芳

(中国中医科学院 中药研究所，北京 100700)

目的：探讨欧洲花楸悬浮细胞生长规律和动力学参数。方法：测定欧洲花楸悬浮细胞生物量及细胞悬浮液pH值变化；利用细胞鲜重和干重值对欧洲花楸悬浮细胞生长曲线进行拟合，用数学建模模拟欧洲花楸悬浮细胞增殖情况，并对拟合函数求一阶、二阶导数，求算欧洲花楸悬浮细胞生长速率及生长加速度。结果：欧洲花楸悬浮细胞液的pH值随培养时间增加而越来越大，培养时间到16 d，pH>6,不再适宜细胞生长；Logistic模型能够描述欧洲花楸悬浮细胞生长曲线变化。培养第5d时细胞增长加速度达到最大，在8 d时生长速率达到最大，结论：欧洲花楸悬浮细胞生长函数符合logistic曲线，函数为f(x)=0.369 9/(1+10.77e-0.329 2x)，细胞在14 d时进入增长平台期，在细胞生长至第5 d时可进行诱导子处理。

欧洲花楸；悬浮细胞；数学建模；Logistic函数模型；细胞悬浮液pH值

欧洲花楸(SorbusaucupariaL.)为蔷薇科花楸属落叶乔木或小乔木，原产欧洲和亚洲西部温带高山区域[1]。含有多酚、花青素、黄酮类等活性成分[2]。其果实、枝叶及茎皮皆可入药。果实收敛、利尿，叶子通便祛瘀[3-5]，是治疗肾病、痛风、风湿、感冒和净化血液的良药[6]。作为植物药，欧洲花楸需要生长一定时间后方可入药，且植株中的药用成分含量低、产量及质量不稳定。用植物细胞培养技术来生产药用次生代谢产物，是目前生物技术重要的研究发展领域。本文以欧洲花楸悬浮细胞为材料，研究其生长特性及次生代谢产物的积累情况，并对细胞生长动力学做了初步研究，为利用该细胞进行实验优化控制和规模生产次生代谢产物提供参考。

1 材料

欧洲花楸悬浮细胞系由中国科学院植物研究所叶和春研究员赠送。

2 仪器与试剂

仪器：培养箱(Conviron Adaptis CMP6010)；摇床(TCYQ超大型摇床)；电子天平(Sartorius BS 2202S)；超净工作台(SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台)；分析型酸度计(JENWAY 3510)；旋转蒸发仪(BUCHI Rotavapor R-200)；高效液相色谱仪(Waters 2695_2996)；其它常规设备。

试剂：甲醇(色谱纯，Fisher Chemical生产)；乙酸乙酯、甲醇、甲酸等(均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司生产)。

3 实验方法

3.1 愈伤组织的培养

诱导出的愈伤组织接种于含50 mL MS固体培养基的400 mL广口瓶中，置于25 ℃培养箱中避光培养，每14 d继代1次。

3.2 细胞悬浮培养体系的建立

愈伤组织经过3～5次继代后，将生长旺盛、结构疏松、易于分散的组织转入液体培养基中，置于摇床上进行悬浮培养，摇床转速设定为120 rmp，培养温度为25 ℃，避光培养，得到含单细胞或小细胞团的培养物继代，继代接种量为1.4 g，于20 mL的MS液体培养基中培养。

3.3 细胞悬浮液pH值测定

采用分析型酸度计直接测定。

3.4 细胞增值测定

将培养的悬浮细胞用蒸馏水冲洗3遍，真空抽滤至不滴水，直接称量细胞鲜重，用鲜重(FCW)表示，每个处理重复4次，结果为4次的平均值。将收获后的细胞在80 ℃烘箱中干燥过夜，至恒重，称量得到细胞干重，用(DCW)表示。取样时间间隔为1 d。

3.5 细胞生长曲线建模方法

根据欧洲花楸悬浮细胞生长曲线，构建Logistic、Gompertz和Gauss模型，利用R2值确定最佳拟合模型，并利用matlab2010b软件，由筛选得到生长曲线函数中求得细胞最大增长速度及加速度参数，

3.6 细胞中次生代谢产物提取和检测方法

将收获的细胞用15 mL甲醇在研钵中研碎，过滤到鸡心瓶中，过滤后的细胞残渣再用10 mL甲醇提取一次，合并滤液，置于旋转蒸发仪上浓缩至干。培养基用15 mL乙酸乙酯萃取两次，用分液漏斗将乙酸乙酯层转移至鸡心瓶中，于旋转蒸发仪上浓缩至干，后用500 μL的甲醇溶解，0.45 μm滤膜过滤，用于HPLC检测。

HPLC测定条件为：4.6×150 mmC18(5 μm)reverse column；流动相为水(0.1%甲酸)：甲醇(50∶50)流速0.7 mL·min-1；全波长紫外检测。

4 结果

4.1 欧洲花楸悬浮细胞液pH值变化

在正常培养条件下，欧洲花楸细胞悬浮液的pH值随着培养时间的延长而增大。细胞培养基初始pH值为4.14，在细胞继代培养1 d后，pH值就升高至4.35。在1～15 d时，细胞悬浮液的pH值缓慢升高；当生长时间<17 d时，细胞悬浮液的pH值<6；当生长时间>17 d时，细胞悬浮液的pH值>6(见图1、表1)。

图1 欧洲花楸悬浮细胞液pH值变化曲线

4.2 欧洲花楸悬浮细胞生长曲线

欧洲花楸悬浮细胞鲜重和干重的生长曲线均为S型，1～5 d内细胞生物量增加较慢；在5～14 d时，细胞鲜重快速增加；在14 d之后，细胞鲜重量下降；在17～20 d时，细胞鲜重渐趋稳定，此时细胞进入生长稳定期。在14 d时，细胞鲜重量达到最大值，为5.29 g/瓶，是初始接种量的8.8倍(见表1、图2及图3)。以上实验结果表明，欧洲花楸悬浮细胞的动力学特性表现：继代后0～5 d是细胞的延滞生长期，5～14 d是细胞的指数生长期，14～20 d细胞处于稳定生长期。在14 d时细胞的鲜重达到最大值，即细胞在14 d之前生长所需的营养物质及生长空间是充足的，细胞增量不受环境因子限制。

图2 欧洲花楸悬浮细胞鲜重增长曲线

图3 欧洲花楸悬浮细胞干重增长曲线

表1 欧洲花楸悬浮细胞生长20d的生物量及细胞悬浮液的pH值(n=4)

4 建模与分析

采用结构模型来描述植物细胞的生长与次生代谢产物的代谢，通过测定与分析细胞内组分的变化，能够更深入地研究植物细胞培养的内在规律。根据模型的描述，针对细胞所处的培养不同阶段，采取不同的优化培养策略，从而分别满足细胞生长和产物代谢的需要，实现对整个培养体系的优化操作。对于S型细胞的生长曲线，人们通常用Logistic模型来描述。但是Logistic模型只能描述环境条件变化对生物种群实际增长率的影响。故本实验选择了Logistic、Gompertz和Gaussian三种模型进行拟合，通过比较其R2值，确定最适拟合欧洲花楸悬浮细胞生长曲线的函数模型，探讨其生长规律，为进行实验优化控制提供依据。

4.1 生长曲线函数模型

从细胞鲜重及干重的拟合结果中可知，欧洲花楸悬浮细胞生物量的增长符合Logistic模型，细胞干重拟合的函数拟合度最高(见表2)，欧洲花楸悬浮细胞的生长函数为：f(x)=0.369 9/(1+10.77e-0.329 2x)，拟合曲线的R2=0.969，对该函数作图(见图4)。可知，Logistic模型能够很好地反映欧洲花楸悬浮细胞生长的各个阶段： 1～5 d为细胞延滞生长期，5～14 d为细胞指数生长期，在17天时已基本到达函数的平台期，17 d之后细胞处于稳定生长期。

表2 模拟欧洲花楸悬浮细胞生长函数参数值

图4 拟合生长曲线的Logistic函数图像

4.2 细胞增长模型求解关键点

将拟合方程的参数代入f(x)=b/(1+ae-kx)中，得到下式：

f(x)=0.369 9/(1+10.77e-0.329 2x)

因为Logistic函数表达的是细胞增长的累积量，为了研究欧洲花楸悬浮细胞增长函数，须对模拟的Logistic函数进行求导。

利用matlab2010b软件，调用diff函数对f(x)进行求一阶导数，得到函数f(x)=5 720 058 669/[125 000 000e0.388 7x(1 167/(50e3 887x+1)2]

对该函数进行作图(见图5)。从图中可以看到，欧洲花楸悬浮细胞增长表现出先增加，后降低的趋势，表明在欧洲花楸悬浮细胞培养前期，细胞增长不受环境约束，细胞增长达到峰值后，环境抑制开始大于细胞增长动力。

对上述函数求极值，当f(x)=0时，得到x=-[10 000 lg(50/1 167)]/3 887求解后的值极为最大增长速率，细胞生长速率变化趋势是先增大后减小，在第8天时细胞增长速率最大。

为了研究欧洲花楸悬浮细胞增长加速度和细胞增长关键点，对模拟Logistic函数求二阶导数并作图(见图6)。可知，细胞增长加速度呈现出先增加后减小的变化趋势，在第5天时细胞增长加速度达到最大值。

图5 Logistic函数一阶导数的函数图形(细胞增长速率)

图6 Logistic函数二阶导数的函数图形(细胞增长加速度)

5 细胞中次生代谢产物检测

在正常培养条件下，对培养了1 d、3 d、10 d，20 d，30 d，35 d的欧洲花楸悬浮细胞次生代谢产物进行HPLC检测，结果表明在细胞内均未检测到次生代谢产物。这与其他的药用植物不同，例如黄芩[7]、人参[8]、丹参[9]、紫草[10]、南方红豆杉[11]等药用植物细胞系在正常培养条件下就可合成次生代谢产物。

6 讨论

细胞材料相比于植株材料，有生长快、容易培养、影响条件易于控制等优点。在植物细胞培养生产次生代谢产物过程中，细胞生长规律、次生代谢产物合成和积累规律，对于植物细胞培养的进一步放大，提高次生代谢产物产率等方面具有重要意义。细胞悬浮液pH值变化反映了培养基成分改变和细胞膜透性及酶活性改变。由欧洲花楸悬浮细胞生长曲线可知，细胞悬浮液的pH随着培养时间增加而逐渐增大，在继代0～14 d，细胞悬浮液pH值<6.0，17 d之后，pH值>6，培养基已不适合细胞生长。

了解细胞在常规培养条件下的动力学特性，是研究利用该细胞的首要条件。常规培养条件下欧洲花楸悬浮细胞的鲜重、干重生长曲线变化，是模拟欧洲花楸悬浮细胞生长函数的基础。欧洲花楸悬浮细胞培养的动力学特性表现为，在继代后的0～5 d，是细胞延滞生长期；在5～14 d时，是细胞指数生长期；在14～20 d时，细胞处于稳定生长期。在14 d时，细胞鲜重达到最大值，第5 d时细胞增长加速度达到最大，在8 d时生长速率达到最大，在细胞生长至第5 d可进行诱导子处理。

次生代谢产物的产生是植物在长期进化过程中与环境相互作用的结果，这些次生代谢物的合成与植物体状态和环境条件有密切联系。不同类型的次生代谢产物，其生物合成途径也不相同。蔷薇科苹果亚科的次生代谢产物是联苯类和二苯呋喃类物质，在植株的边材部分合成，作为化学防御措施以抵御各种胁迫。有报道，当欧洲花楸的叶子受到真菌感染时，植物组织合成了抗真菌类病害的植保素[12]。欧洲花楸为抵抗生物和非生物胁迫在叶子中合成联苯欧洲花楸素[13]。也有资料表明，在用酵母提取物处理后，欧洲花楸悬浮细胞会很快合成并积累aucuparin[14]。而在本实验培养和检测条件下，对培养1 d、3 d、10 d、20 d、30 d、35 d的欧洲花楸悬浮细胞进行次生代谢产物检测，均未检测到联苯类物质。在使用其他特定环境因子诱导下，欧洲花楸悬浮细胞是否合成联苯类次生代谢产物，还需要深入研究。

致谢：感谢北京市中药学重点学科资助。

[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志(第三十六卷)[M].北京：科技出版社,1974,284.

[2] 于明,李铣.花楸属植物化学成分 药理作用及其研究进展[J].辽宁中医学院学报,2004,6(5)：364-366.

[3] 江苏新医学院.中药大辞典(上册)[M].上海：上海人民出版社,1979：335.

[4] 新疆自治区卫生厅.新疆自治区药品标准 [M].乌鲁木齐，1987：4.

[5] 周丹,宿宗艳,李文娟,等.欧洲花楸应用价值的探讨[J].中国林副特产,2007,5(90)：83-86.

[6] 余治家,于澎湃,等.多用途树种欧洲花楸及其引种[J].中国城市林业,2007,5(6)：56-59.

[7] 方强,乔勇进.黄芩愈伤组织诱导和细胞培养研究进展[J].天然产物研究与开发,2008,20：187-192.

[8] 陈巍,高文远,贾伟,等.人参属药用植物组织和细胞培养的研究进展[J].中草药,2005,36(4)：616-620.

[9] 冯玲玲,丹参组织培养的初步研究[D].华中师范大学,2004.

[10] 严海燕,曹日强.紫草组织培养中细胞发育时期与紫草宁形成关系的研究[J].中草药,2001,32(3)：264-266.

[11] 盛长忠,王淑芳,王宁宁,等.南方红豆杉愈伤组织培养的研究[J].中草药,2000,31(2)：130-132.

[12] Kokubun T,Harborne JB. Phytoalexin induction in the sapwood of plants of the Maloideae(Rosaceae) biphenyls or dibenzofurans[J]. Phytochemistry,1995,40：1649-1654.

[13] Kokubun T,Harborne JB. A survey of phytoalexin induction in leaves of the Rosaceae by copper ions[J]. Z. Naturforsch. 1994,49c：628-634.

[14] Liu B,Beuerle T,Klundt T,Beerhues L. Biphenyl synthase from yeast-extract-treated cell cultures of Sorbus aucuparia[J]. Planta,2004,218：492-496.

StudyontheGowthKineticsofSorbusSucupariaL.inSuspensionCulturedCells

XIAO Wen-juan，YANG Guang，GUO Lan-ping，HAO Qing-xiu，LIN Shu-fang

(InstituteofChineseMateriaMedica，AcademyofTraditionalChineseMedicine，Beijing100700，China)

Objective： We want to make a model of the Cell Suspension Culture ofSorbusaucupariaL.and obtain the Kinetics parameters.Methods：The growth cycle of 20 d and the pH value of cells suspension liquid ofSorbusaucupariawas measured under normal culture conditions.The growth curve of suspension cultured cells ofSorbusaucupariawas fit by using the fresh weight and dry weight of cells.The growth cycle of suspension cultured cells ofSorbusaucupariawas determined by Logistic function model.Results：The pH of cell suspension increased overtimeobviously during 0～14 d.When the pH of suspension cultured cells is over 6，this is not suitable for the growth of cells.The Logistic function model can fit the change of the growth curve of suspension cultured cells ofSorbusaucuparia.The best growth rate and growth acceleration of suspension cultured cells ofSorbusaucupariais 5 d and 8 d respectively.Conclusion:The function of growth characteristics of suspension cultured cells ofSorbusaucupariaisf(x)=0.369 9/(1+10.77e-0.329 2x).SorbusaucupariaL.cells growth plateau occurson the 14 th day，and reach the fastest speed on the 8th day.Elicitors could be used on the fifth day.

Suspension cultured cells ofSorbusaucupariaL.;Mathematical model;Logistic function model;pH of cell suspension liquid

2012-12-18)

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国家自然科学基金(81130070，81072989)，国家中医药管理局行业科研专项(201107009)，国家科技重大专项(2009ZX09502-026，2009ZX09301-005)；中国中医科学院课题ZZ20090302；中国南非合作项目(2009DFA31660)

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郭兰萍，Tel：(010)64011944，E-mail：glp01@126.com