人AQP5真核表达质粒的构建及其在胃癌细胞中的表达

黄永红，徐方云，吕农华

（1.南昌大学第一附属医院消化内科，南昌 330006；2.南昌大学基础医学院病理生理教研室，南昌 330006）

水通道蛋白5（aquaporin 5，AQP5）是跨膜水通道蛋白家族的重要成员之一，广泛分布于分泌性腺体上皮组织和细胞，在体内水平衡和腺体分泌等方面起着重要作用［1］。新近研究表明，AQP5在多种肿瘤组织细胞中呈异常表达，可能通过调节肿瘤细胞的增殖与转化［2］、影响肿瘤细胞的侵袭与迁移等参与肿瘤的发生与发展［3］。因此，AQP5正成为肿瘤研究的新领域。本研究运用分子生物学方法，构建人AQP5重组质粒并将其导入人胃癌细胞株AGS细胞中，从而获得稳定表达AQP5基因的AGS细胞系，为进一步研究AQP5基因对胃癌恶性表型的影响奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃癌细胞株AGS为本研究所保种；pcDNA 3.1／myc-His质粒为本院科研中心罗时文教授馈赠；总RNA提取液（TRIzol）、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）试剂盒为北京TransGen公司产品；脂质体Lipofectmine2000试剂为美国Invitrogen公司产品；限制性核酸内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、T4DNA连接酶为日本TaKaRa公司产品；质粒小提试剂盒及胶回收试剂盒为Omega公司产品；兔抗人AQP5抗体为Abcam公司产品；鼠抗人β-肌动蛋白（β-actin）抗体为Santa Cruze公司产品；遗传霉素（G418）为 Merck公司产品；美国Invitrogen公司完成引物合成；北京诺赛基因公司完成基因测序。

1.2 方法

1.2.1 人AQP5真核表达质粒的构建 根据序列数据库GenBank中人AQP5的mRNA序列设计特异性引物。引物序列：上游5′-GCGAT GAA GAA GGA GGT GTG CTC CGT-3′（BamHⅠ）；下游5′-CCGTCA GCG GGT GGT CAG CTC C-3′（EcoRⅠ），下划线示酶切位点（BamHⅠ、EcoRⅠ）。用PCR法扩增获得AQP5目的片段，产物长度为810bp。对扩增的AQP5基因片段和载体pcDNA3.1／myc-His分别用EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切。酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳（110V，35min），电泳片段用凝胶回收试剂盒回收。AQP5目的片段与线性载体分别按摩尔比3∶1、6∶1和9∶1用T4DNA连接酶进行连接，4℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞后，接种于含氨苄西林100μg／mL的Lu-ria-Bertani（LB）固体培养基平板，37℃筛选过夜。挑取阳性克隆摇菌提取质粒，质粒用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定。将酶切鉴定正确的阳性质粒送北京诺赛基因公司进行测序鉴定。

1.2.2 细胞培养及质粒转染 转染前24h取对数生长期AGS细胞，调整细胞密度为1×105／mL，接种于12孔培养板，次日进行转染。随机分为对照组、空载体组和AQP5转染组。转染前弃含血清双抗培养基，磷酸缓冲盐溶液（PBS）漂洗2遍后，每孔加无血清无双抗Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）1mL，将质粒（μg）和Lipofectmine 2 000（μL）按1∶3的比例分别用100μL无血清培养基稀释，各自轻轻混匀静置5min后，再混合两者静置20min，将混合液均匀加至相应的细胞中，于37℃CO2孵育箱中培养5h后更换10%胎牛血清含青链双抗的DMEM培养基继续培养。

1.2.3 G418筛选浓度的确定及AGS细胞阳性克隆的筛选将AGS细胞以5×104／mL密度接种于12孔培养板中，24h后，将G418与含血清的DMEM培养基混合，配成浓度分别为0、100、200、300、400、500、600、700、800、900和 1 000mg／L 的液体，每隔3d换液一次，培养10d，以10d90%细胞致死量为最佳筛选浓度，因此确定400mg／L为最佳筛选浓度。转染24 h后按1∶10传代于24孔板，细胞贴壁后加入含400mg／L G418的完全培养基培养14d至筛选出阳性克隆；挑取阳性克隆继续扩大培养，筛选出的稳定细胞株分别命名为AGS／AQP5细胞（转染AQP5的细胞）和AGS／EV细胞（转染空载体的细胞），用200mg／L G418维持培养。

1.2.4 RT-PCR检测细胞AQP5mRNA表达 TRIzol法抽提AGS（对照组）、AGS／AQP5（AQP5 组）和 AGS／EV（空载组）细胞总RNA，按逆转录试剂盒说明进行逆转录获取cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。AQP5引物序列：上游5′-CTT CCT CAA GGC CGT GTT C-3′；下游 5′-CTC CTC CCA GTC CTC GTC A-3′；内参β-actin引物序列：上游 5′-CGG GAA ATC GTG CGT GAC-3′；下游5′-TGG AAG GTG GAC AGC GAG G-3′。反应条件94℃预变性4min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，72℃继续延伸7min。取10μL PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析进行分析，以目的条带AQP5与β-actin灰度值的比值反映AQP5mRNA相对表达水平。实验重复至少3次。1.2.5 蛋白质印迹法（Western Blot）检测细胞AQP5蛋白表达 收集对照组、AQP5组和空载组细胞，细胞裂解液提取总蛋白。BCA法进行蛋白含量测定。取总蛋白50μg／孔在10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）40V，30 min后改电压为80V，120min后至溴酚蓝跑至胶最下方取胶，将分离的蛋白转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，25V90min进行转膜。转膜后5%脱脂奶粉含0.1%叶吐温20Tris缓冲溶液（TBST）4℃封闭60min；加入一抗孵育（AQP5 1∶500，β-actin 1∶500）4℃过夜，TBST洗膜3次，10min／次，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗（1∶5 000）孵育，4℃5h，洗膜，曝光、显影、定影。Gel-pro凝胶成像分析软件分析AQP5蛋白和β-actin蛋白的灰度值，并计算其比值反映AQP5蛋白相对表达水平。实验重复至少3次。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件分析，数据以表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 克隆的双酶切及序列测定 重组质粒双酶切后琼脂糖电泳约在810bp和5 480bp附近分别见一明显条带，与目的片段大小相符，见图1，北京诺赛基因公司测序结果与GenBank中人AQP5（NM＿001651.2）的核苷酸序列完全一致。

图1 酶切鉴定电泳图

图2 RT-PCR检测各组AGS细胞AQP5mRNA的表达

图3 Western Blot检测各组AGS细胞AQP5蛋白的表达

2.2 AQP5mRNA的表达 外源AQP5转染AGS细胞后，AQP5mRNA表达水平显著上调，AQP5组与对照组、空载组比较，AQP5mRNA水平显著上调，差异有统计学意义（P＜0.05），而对照组与空载组比较mRNA表达差异无统计学意义（P=0.355），见图2。

2.3 AQP5蛋白的表达 外源AQP5转染AGS细胞后，AQP5蛋白表达水平显著上调，AQP5组与对照组、空载组比较，AQP5蛋白水平显著上调，差异有统计学意义（P＜0.05），而对照组与空载组比较蛋白表达差异无统计学意义（P=0.181），见图3。

3 讨 论

水的微环境是细胞内外一切生命活动进行的场所，肿瘤的发生、发展也离不开水的微环境。而且，肿瘤细胞为了满足快速增殖、分裂及向周围基质侵袭和转移的需要，一系列酶的活性和表达发生改变，细胞基本结构成分合成明显加强；同时癌细胞向周围基质侵袭和进出血管／淋巴管时需要体积和外形发生相应改变［4］。因此，肿瘤细胞比正常细胞更需要水分子的快速跨膜转运。

近年文献报道AQP5蛋白过度表达于多种肿瘤组织中［5-8］，并与某些肿瘤的进展、化疗药物的耐受及患者的预后相关。体外实验表明，AQP5参与肿瘤生物学行为的形成。Chae等［9］发现过表达AQP5的K562细胞和LAMA84细胞增殖能力增强。Chen等［10］采用RNA干扰（RNAi）技术沉默 AQP5基因表达可明显减少人肺癌细胞株SPC-A1细胞的迁移和侵袭能力，且认为其迁移和侵袭能力下降与沉默AQP5基因，降低细胞水的通透性，调节细胞大小和形态有关。Jung等［11］在乳腺癌研究中亦发现乳腺癌细胞MCF7AQP5表达与肿瘤细胞的增殖和转移能力相关。Chae等［7］的研究表明，外源性表达AQP5的正常肺上皮细胞株BEAS-2B可发生上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT），细胞呈成纤维样改变，失去细胞-细胞间连接和细胞极性，而且细胞上皮标志蛋白表达下调、间质标志蛋白表达则上调，提示AQP5可通过EMT促进肿瘤细胞的侵袭和转移。此外，动物实验表明AQP5过表达可诱导荷瘤动物肿瘤发生转移［12］。目前病理组织学研究发现［13-14］，正常胃黏膜组织中AQP5呈低表达，而胃癌组织中AQP5呈高表达，提示AQP5可能参与胃癌的发生与发展。但是，AQP5基因在胃癌发生发展中究竟发挥何种作用，有待深入研究。

总之，本研究通过Western Blot和RT-PCR实验证实已成功筛选出稳定表达外源性人AQP5基因的AGS胃癌细胞株，这为进一步研究AQP5基因在胃癌发生发展中可能扮演的角色奠定实验基础。

［1］张景熙，李强，刘忠令.AQP5的结构功能及其调节［J］.国外医学：生理、病理科学与临床分册，2003，23（6）：599-601.

［2］Woo J，Lee J，Chae YK，et al.Overexpression of AQP5，a putative oncogene，promotes cell growth and transformation［J］.Cancer Letters，2008，264（1）：54-62.

［3］Chen ZH，Wang XD，Bai CX，et al.Regulation of MUC5AC mucin secretion by depletion of AQP5in SPC-A1cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，342（3）：775-781.

［4］Verkman AS，Hara-Chikuma M，Papadopoulos MC.Aquaporins-new players in cancer biology［J］.J Mol Med，2008，86（5）：523-529.

［5］Burghardt B，Elkjær ML，Kwon TH，et al.Distribution of aquaporin water channels AQP1［J］.Gut，2003，52（7）：1008-1016.

［6］Kang SK，Chae YK，Woo J，et al.Role of human aquaporin 5in colorectal carcinogenesis［J］.Am J Pathol，2008，173（2）：518-525.

［7］Chae YK，Kang SK，Kim MS，et al.Expression of aquaporin 5（AQP5）promotes tumor invasion in human non small cell lung cancer［J］.PLoS ONE，2008，3（5）：e2162.

［8］Zhang Z，Chen Z，Song Y，et al.Expression of aquaporin 5 increases proliferation and metastasis potential of lung cancer［J］.J Pathol，2010，221（2）：210-220.

［9］Chae YK，Kang SK，Kim MS，et al.Human AQP5plays a role in the progression of chronic myelogenous leukemia（CML）［J］.PLoS ONE，2008，3（7）：e2594.

［10］Chen Z，Zhang Z，Gu Y，et al.Impaired migration and cell volume regulation in aquaporin 5-deficient SPC-A1cells［J］.Respir Physiol Neurobiol，2011，176（3）：110-117.

［11］Jung HJ，Park JY，Jeon HS，et al.Aquaporin-5：a marker protein for proliferation and migration of human breast cancer cells［J］.PLoS ONE，2011，6（12）：e28492.

［12］Zhang ZQ，Zhu ZX，Bai CX.Lung fluorescence imaging to evaluate tumor metastasis induced by AQP5expression in murine model［J］.Med Oncol，2012，29（1）：205-211.

［13］Watanabe T，Fujii T，Oya T，et al.Involvement of aquaporin-5in differentiation of human gastric cancer cells［J］.J Physiol Sci，2009，59（2）：113-122.

［14］Shen L，Zhu Z，Huang Y，et al.Expression profile of multiple aquaporins in human gastric carcinoma and its clinical significance［J］.Biomed Pharmacother，2010，64（5）：313-318.