辛伐他汀对ApoA5表达的影响＊

李全忠，王杨阳，阳跃忠，夏中华，孙 婧

（桂林医学院附属医院心血管内科，广西桂林 541001）

血脂的高低与冠心病的发生率和死亡率直接相关。血浆高密度脂蛋白（HDL）水平与动脉粥样硬化性心血管疾病的发病率呈负相关。血浆三酰甘油（TG）浓度升高也被证实是冠心病的独立危险因素［1］。目前临床上应特别重视血浆总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）升高，同时也应关注高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）低下和TG升高。

载脂蛋白A5（apolipoprotein A5，ApoA5）是迄今为止第一个过度表达引起血浆TG下降的载脂蛋白。与相同剂量的洛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀等其他β-羟-β-甲戊二酸单酰辅酶a（HMG-CoA）还原酶抑制剂相比，辛伐他汀可以更有效地降低血清中的TC和LDL-C［2］。除此之外，辛伐他汀升高HDLC及降低TG的总有效率分别为48.1%及58.2%［3］。结合ApoA5与HDL-C正相关且血清中TG增高和ApoA5下降有一定关系的研究结果，推测辛伐他汀可能通过影响ApoA5的表达从而起到升高HDL-C及降低TG的作用。作者以人肝癌细胞株 G2（human hepatic cancer cell line G2，HepG2）为模型，观察辛伐他汀对ApoA5的影响，从而更好地阐述辛伐他汀对血脂代谢影响的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）细胞：HepG2由桂林医学院实验中心提供；（2）试剂：辛伐他汀原药粉、兔抗人载脂蛋白A5抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG均购自美国Sigma公司，胎牛血清、细胞培养基（DMEM）均购自美国Gibco公司，聚合酶链式反应（PCR）试剂盒购自上海易利生物科技有限公司；（3）主要仪器：CO2培养箱购自美国Precision公司，超净工作台购自江苏苏净集团安康公司，德国Eppendof冷冻离心机购自德国Eppendorf公司，北京六一电泳仪购自北京沃德生物医学仪器公司，捷达801凝胶成像分析系统购自江苏省捷达科技发展有限公司，ABI9700基因扩增仪购自上海天呈科技有限公司，达晖DHB-30恒温金属浴购自广州达晖生物技术有限公司。

1.2 细胞的培养 HepG2细胞培养于DMEN（含12%胎牛血清、100μg／mL青霉素、100μg／mL链霉素）。细胞种在25 cm2的培养瓶中，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱，每隔2d换液一次，视细胞生长状态扩大培养，然后取对数生长期的细胞，在细胞计数板上计数后将其接种到6孔培养板（接种细胞浓度为1×105个／孔，每孔3mL培养液），待细胞融合生长到50%～70%。开始实验前，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗细胞2次，然后加入含有不同浓度（0、1、5、10、25、50μmol／L）辛伐他汀的DMEM，3毫升／孔，于37℃培养48h。收集 HepG2细胞，分别吸取每孔培养液平均分配至两个1.5mL离心管中，冻存于-20℃。吸弃剩余的培养液。然后每孔加入细胞裂解液500μL，室温放置5min后转移到1.5mL离心管中，冻存于-80℃，备用。

1.3 PCR检测 根据Trizol总RNA提取试剂盒中的说明书提取细胞内RNA，合成cDNA，然后用ABI9700基因扩增仪扩增cDNA，ApoA5与作为内参的磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）引物序列为。ApoA5引物序列：上游5′-AGC AGA TAA TGG CAA GCA TGG CTG C-3′；下 游 5′-GCA GCC ATG CTT GCC ATT ATC TGC T-3′。产物大小为280bp。为保证各RNA样本量的均一性，采用GAPDH作为内参。GAPDH引物序列：上游5′-AAC GTG TCA GTG GTG GAC CT-3′；下游5′-AGG GGA GAT TCA GTG TGG TG-3′。产物大小为400bp。PCR产物加载药缓冲液混匀，2%琼脂糖凝胶100V电泳30min。用捷达801凝胶成像分析系统中进行灰度扫描，目的基因mRNA表达量用每例标本目的基因的平均灰度值／同一标本GAPDH的平均灰度值来表示。

1.4 蛋白质印迹法（Western Blot）检测 在收集好的细胞中加入细胞裂解液裂解细胞，4℃冰浴10min，15 000r／min离心5min，弃除沉淀，二辛可酸（BCA）法蛋白定量。取50μg蛋白加入2倍浓度十二烷基磺酸钠（SDS）凝胶加样缓冲液中，100℃水浴10min，立刻置于冰上备用。6%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转PDVF膜。置膜于5%脱脂奶粉。封闭缓冲液1h，室温缓慢摇动，按1∶500加入ApoA5一抗，室温孵育1h，缓慢摇动，1倍浓度洗涤缓冲液（TBST）洗膜5次，每次5 min。按1∶4 000加入辣根过氧化物酶标记（HRP）的二抗，室温孵育1h，缓慢摇动，1倍浓度TBST洗膜5次，每次5min。在暗室中与化学发光剂免疫印迹化学发光（ECL）反应，X线胶片曝光显影，观察分析。

2 结 果

2.1 辛伐他汀对HepG2细胞ApoA5mRNA表达的影响各组 ApoA5分别为对照组0.222±0.022、1μmol／L组0.348±0.031、5μmol／L 组 0.42±0.027、10μmol／L 组0.47±0.025、25μmol／L 组 0.61±0.013、50μmol／L 组0.56±0.022。与对照组比较，不同浓度的辛伐他汀（1、5、10、25μmol／L）组ApoA5mRNA均显著上调，并且升高程度随辛伐他汀干预浓度的增加而增加（P＜0.05）。各组间两两比较，其水平差异有统计学意义（P＜0.05）。至浓度为50μmol／L时，辛伐他汀对ApoA5mRNA上调作用较25μmol／L组反而有所下降，这说明辛伐他汀对ApoA5mRNA的上调作用呈剂量依赖性，但却有最高上限浓度。见图1。

2.2 辛伐他汀对HepG2细胞ApoA5蛋白表达的影响Western Blot检测ApoA5蛋白表达与对照组比较，不同浓度的辛伐他汀（1、5、10、25μmol／L）组 ApoA5蛋白表达亦显著上调，并且升高程度随辛伐他汀干预浓度的增加而增加（P＜0.05）；各组间两两比较，其水平差异有统计学意义（P＜0.05）；当辛伐他汀浓度达50μmol／L时，辛伐他汀对ApoA5 mRNA上调作用较25μmol／L组反而有所下降，与PCR所得结果一致，再次证明辛伐他汀对ApoA5mRNA的上调作用呈剂量依赖性，但却有最高上限浓度这一观点。见图2、3。

图1 不同浓度的辛伐他汀作用后，用PCR法扩增的ApoA5mRNA及GAPDH的表达

图2 不同浓度辛伐他汀作用后，Western Blot检测ApoA5蛋白及GAPDH表达

图3 不同浓度辛伐他汀作用后，检测的各组ApoA5蛋白相对IOD值

3 讨 论

冠心病由于其发生率、死亡率均很高，一直是国内外医学研究的热点。目前研究认为，冠心病的发生、发展与多种遗传和环境因素有关［4］。而血脂异常是冠心病的主要独立危险因素。在形成动脉粥样硬化的各因素中，血脂代谢异常起着重要的作用，除高TC血症外，血清TG浓度升高在冠心病发生、发展中的作用也逐渐得到肯定，HDL则是冠心病的保护因子，HDL-C代表HDL中胆固醇的含量，在血脂中起的作用是参与胆固醇的逆转录，是一种抗动脉粥样硬化的血浆脂蛋白，是冠心病的保护因子。当HDL-C含量过低时，即使TC在合适水平，也会显著增加冠心病的危险。

Pennacchio等［5］和van der Vliet等［6］通过比较小鼠与人的基因组DNA发现了一种新的载脂蛋白基因——ApoA5，它与已知的ApoA1／C3／A4基因簇相距约30kb。基因全长1 889bp，由4个外显子，3个内含子构成，编码366个氨基酸［7］，主要分布在极低密度脂蛋白（VLDL）、HDL和乳糜微粒中［8］。它能与血浆脂质结合，构成脂蛋白的主要成分，是决定脂蛋白结构、功能和代谢的核心组分，其结构和合成异常将影响血脂代谢。有学者推测ApoA5可能具有脂质转运功能［9］，能清除组织中的脂质和抗动脉粥样硬化。在后续的实验中发现，ApoA5主要影响血浆TG代谢，ApoA5基因变异与血浆TG水平增高及家族性混合型高脂血症有关，血浆ApoA5浓度与TG浓度呈负相关，提示ApoA5有降TG的作用。带ApoA5腺病毒载体小鼠的血浆TG和TC浓度分别降低了70%和40%，原因是ApoA5过度表达后极大地降低了VLDL的比例，从而降低TG水平，也使脂蛋白中的胆固醇减少，其中HDL中的胆固醇降低幅度最大，从而使血浆TC浓度降低［10］。在老年人群中，血清ApoA5水平与血清TG水平呈显著负相关，这也支持ApoA5是TG代谢的一个重要决定因素［11］。何成毓等［12］和Grosskopf等［13］的研究均显示，ApoA5与TG呈负相关，与HDL-C呈正相关，多元回归分析显示，TG、HDL与ApoA5有关。

辛伐他汀不仅可以有效地降低血清中的TC和LDL-C，而且也有增高HDL-C及降低TG的作用，曾群英等［14］在一项关于辛伐他汀治疗69岁以上老年高脂血症患者的安全性及临床疗效的报道中指出，辛伐他汀治疗24周后TC、TG、LDL-C均较治疗前明显下降（P＜0.01），HDL-C则较治疗前显著上升（P＜0.01），与安慰剂比较，辛伐他汀显著降低TC、TG、LDL-C（P＜0.01），显著升高 HDL-C水平（P＜0.01）。

李琰［15］调查78例患者经16周口服辛伐他汀治疗后，与治疗前相比，TG、TC、LDL-C值均显著下降（P＜0.05），HDLC值显著上升（P＜0.05）。

在本实验中，作者以不同浓度的辛伐他汀（1、5、10、25、50 μmol／L）作用于 HepG2细胞，体外培养48h后，以PCR和Western Blot法，于基因水平及蛋白水平分别检测ApoA5，结果发现，随着辛伐他汀浓度的增加（1、5、10、25、50μmol／L），ApoA5的表达明显增加，通过单因素方差分析检验，各组间水平差异具有统计学意义（P＜0.05），通过实验所得IOD值，可以直观地看到当辛伐他汀达到一定浓度时（50μmol／L），载脂蛋白的表达量反而较前一组（25μmol／L）有所下降，推测辛伐他汀上ApoA5的表达有一定的浓度上限，两种方法测量所得结果一致。由此推测辛伐他汀可通过上调ApoA5而达到影响血脂水平的作用，这为进一步研究辛伐他汀的调脂机制提供又一新的思路，并为其提供一定的理论基础。

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