HPLC法测定三叉苦中异吴茱萸酮酚含量

李洪福，王勇，魏娜，李永辉

（海南医学院药学院热带药用植物研究开发重点实验室，海南 海口 571101）

HPLC法测定三叉苦中异吴茱萸酮酚含量

李洪福，王勇，魏娜，李永辉*

（海南医学院药学院热带药用植物研究开发重点实验室，海南 海口 571101）

目的：建立HPLC法测定三叉苦中异吴茱萸酮酚含量的方法，为三叉苦药材的质量控制和评价提供科学依据。方法：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈－醋酸水体系洗脱，体积流量为1.0mL·min－1，柱温30℃，检测波长为230nm。结果：在线性范围29.5～442.8μg，异吴茱萸酮酚对照品的标准曲线呈良好的线性关系，r＝0.998 8，该方法的平均回收率为103.9％，RSD＝0.90％。结论：本方法快速、简便、重复性好，可用于三叉苦中异吴茱萸酮酚的含量测定。

三叉苦；异吴茱萸酮酚；HPLC；苯并二氢吡喃类

三叉苦Evodia lepta（Spr.）Meer.是芸香科吴茱萸属植物，又称三丫苦、三桠苦、三枝枪、小黄散、鸡骨树、三叉虎，广泛分布于我国东北至西南各地，是岭南常用中草药，始载于《岭南采药录》，性味苦，寒，具有清热解毒，祛风除湿的功效［1］。对于三叉苦药材中化学成分的研究主要集中在苯并二氢吡喃类和生物碱类化合物上［2-4］。其中在苯并二氢吡喃类化合物中，异吴茱萸酮酚分离得到的较早，其同类化合物结构的确证也是以该化合物为基础进行化学结构沟通并依据相关波谱数据进行的。因此，本实验以异吴茱萸酮酚为对照品，建立三叉苦中异吴茱萸酮酚含量的HPLC测定方法，为三叉苦药材及其成方制剂的质量控制和科学评价提供依据。

1 材料与仪器

日本岛津高效液相色谱仪（LC-6AD泵，SPD-10A检测器，自动进样），色谱柱：Kromasil C18柱（250mm×4.6mm，5μm），乙腈和甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

三叉苦药材由中国医学科学院药用植物研究所海南分所采集提供，经海南医学院药学院杨卫丽老师鉴定为芸香科植物三叉苦 Evodia lepta（Spr.）Meer.。异吴茱萸酮酚对照品由海南医学院药学院植物化学实验室分离制备，经光谱分析并对照文献鉴定为异吴茱萸酮酚［5］，经DAD检测器检测，采用面积归一化法计算其纯度大于99％。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Kromasil C18柱（250mm×4.6mm，5μm），柱温为30℃，检测波长为230nm，体积流量为1.0mL·min－1，进样量为20μL，流动相为乙腈-0.1％醋酸水（55∶45）。理论塔板数按异吴茱萸酮酚计算大于10 000，供试品中异吴茱萸酮酚与其他成分达到了有效分离，分离度大于1.5，对照品及供试品的色谱见图1。

图1 三叉苦和对照品的HPLC图

2.2 对照品溶液的制备

精密称定异吴茱萸酮酚对照品0.036 9g，置于25mL容量瓶中，用色谱纯甲醇稀释至刻度，得1.476mg·mL－1的对照品储备液，精密吸取上述储备液1.00mL置10mL容量瓶中，用色谱纯甲醇稀释至刻度，得147.6μg·mL－1的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密称定1.000g三叉苦药材粉末，共3份，置磨口三角瓶中，分别精密吸取50.00mL 50％乙醇置上述3份三叉苦药材粉末中，称重，水浴加热回流提取1h，再称重，用50％乙醇补足减失的重量，过滤后取续滤液即得。

2.4 线性关系考察

取对照品储备液适量，配制成29.52，73.80，147.6，221.4，295.2，442.8μg·mL－1系列对照品溶液，各取20μL，进样测定，记录色谱图，以进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y＝32 017X－33 923，r＝0.998 8，表明异吴茱萸酮酚在29.5～442.8μg线性关系良好。

2.5 精密度试验

精密吸取147.6μg·mL－1异吴茱萸酮酚对照品溶液20μL重复进样6次，测定峰面积，计算得异吴茱萸酮酚峰面积的RSD＝0.94％。

2.6 重复性试验

精密称定约1.000g共6份三叉苦药材粉末，置磨口三角瓶中，吸取50.00mL 50％乙醇，称重，水浴加热回流提取1h，再称重，用50％乙醇补足减失的重量，过滤后取上述6份乙醇提取液的续滤液，进样20μL，计算得异吴茱萸酮酚峰面积的RSD＝1.06％。

2.7 加样回收率试验

精密称定0.500g三叉苦药材粉末9份，置磨口三角瓶中，1～3份加入1.476mg·mL－1储备液1mL；4～6份加入1.476mg·mL－1储备液1.5mL；7～9份加入1.476mg·mL－1储备液2.0mL；挥干甲醇，精密吸取50.00mL 50％乙醇，称重，水浴回流提取1h，再称重，用50％乙醇补足减失重量，过滤后取上述9份提取液的续滤液，在上述色谱条件下进样20μL，结果见表1。

2.8 样品测定

取3份三叉苦药材粉末，分别按供试品溶液制备项下方法处理，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μL注入高效液相色谱仪，按上述色谱方法进行测定，平行操作3次，外标法计算含量，3份药材中异吴茱萸酮酚的含量分别为4.76，4.79，4.75mg·g－1，平均含量为4.77mg·g－1。

表1 异吴茱萸酮酚加样回收试验

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法的考察

本实验考察了乙醇超声提取和乙醇回流提取两种方法制备三叉苦药材中的异吴茱萸酮酚，结果乙醇回流提取的效率较超声提取好。对于乙醇回流提取法，分别采用75％、50％、40％、30％乙醇进行提取，提取时间分别设定为20min、30min、1.5h及2.0h，结果50％的乙醇回流提取1h为最佳提取方式。

3.2 色谱条件的选择

检测波长的选择：本实验称取约2.000g三叉苦药材粉末，用95％乙醇50mL水浴加热回流提取1h，取续滤液，进样20μL，通过Waters高效液相色谱仪中全波长检测器扫描，选择异吴朱萸酮酚的最大吸收波长230nm作检测波长。

流动相的选择：本实验还对3种不同的流动相：（1）甲醇-0.1％磷酸水（55∶45）；（2）乙腈-0.1％磷酸水（55∶45）；（3）乙腈-0.1％醋酸水（55∶45）进行了考察，结果以乙腈-0.1％醋酸水（55∶45）为流动相效果较好。

本实验采用乙醇回流提取的方法制备三叉苦供试液，以本实验室分离纯化的异吴茱萸酮酚为对照品建立了三叉苦中异吴茱萸酮酚含量的HPLC测定方法，该方法快速、简便、重复性好，可用于三叉苦药材中异吴茱萸酮酚的含量测定。

［1］江苏新医学院.中药大辞典［M］.上册.上海：上海科学技术出版社，1977：68.

［2］李国林，朱大元.三个新2，2-二甲基苯并二氢吡喃类化合物的分离与鉴定［J］.植物学报，1997，39（7）：670-674.

［3］刁远明，高幼衡，彭新生，等.三叉苦化学成分研究（I）［J］.中草药，2004，35（10）：1098-1099.

［4］刁远明，高幼衡，彭新生，等.三叉苦化学成分研究（Ⅱ）［J］.中草药，2006，37（9）：1309-1311.

［5］李硕果，杨茵，叶文才，等.三桠苦的化学成分研究［J］.中草药，2010，41（7）：1052-1056.

2012年中医药十大新闻揭晓

日前，由国家中医药管理局新闻办公室和中国中医药报社共同主办的2012年中医药十大新闻评选揭晓。分别是：

1.中医药事业发展“十二五”规划颁布实施，重大项目扎实推进；

2.中医药积极参与医改，国家实施基层中医药服务能力提升工程；

3.中医药服务贸易纳入国家贸易发展战略，提出用5年时间，基本建立起以国际市场需求为导向的中医药服务贸易促进体系和国际营销体系；

4.《藏医药大典》、《中国军事本草》出版发行；

5.《中医药标准化中长期发展规划纲要》颁布实施；

6.首批64家学术流派传承工作室确定；

7.中药首次以药品进入欧洲市场；

8.“养熊取胆”、“打通任督二脉”两中医药话题引发社会关注；

9.首批15种中医药文化科普图书向公众推荐；

10.中医药应急救治体系初步形成，应对突发公共事件能力提升。

（信息来源：中国中医药报）

Determ ination of Isoevodionol in Evodia lepta（Spr.）M eer.by HPLC

LIHong-fu，WANG Yong，WEINa，LIYong-hui*
（School of Pharmaceutical Science，Hainan Medical University，Haikou 571101，China）

Objective：To establish the method of determine the content of isoevodionol in Evodia lepta（Spr.）Meer.by HPLC.The result provided the basis for the effective quality control and evaluation of thematerial.M ethods：The Kromasil C18column（250mm×4.6mm，5μm）was used.The mobile phase was consisted of acetonitrile-0.1％acetic acid water（55∶45）with a flow rate at 1.0mL·min－1.The column temperature was 30℃.The detection wavelenghth was230nm.Results：Therewas a good linear relationship in the range of29.5～442.8μg（r＝0.998 8）.The average recovery was 103.9％ （RSD＝0.90）.Conclusion：The method was efficient and appropriate with a good repeatability.It can be used for the control of Evodia lepta（Spr.）Meer..

Evodia lepta（Spr.）Meer.；Isoevodionol；HPLC；Benzodihydropyran

2012-06-01）

*［通讯作者］李永辉，Tel：（0898）66895337，E-mail：lyhssl＠126.com