石榴皮总黄酮的微波提取工艺及含量测定研究

霍文 张卫国 王雅宁

（河北联合大学，河北 唐山 063000）

石榴皮是石榴科植物石榴（Punica granatum L.）的干燥果皮，为《中国药典》历版收载的品种，具有涩肠、止血、驱虫等功效[1]，含有黄酮类、鞣质类、有机酸类等多种化合物。近年来发现黄酮类化合物的生理活性较为广泛，在抗诱变、抗肿瘤、抗微生物、抗衰老等方面具有良好的作用，并具有清除自由基和抗氧化的能力。此外，黄酮类化合物还能调节心肌收缩、降血压、防止血管破裂、止血、抗炎、调节免疫、抗微生物、抗肿瘤和改善心肌舒张功能，可以提高机体在常压与低压下的耐缺氧能力，对抗各种因素造成的心律失常[2]。本实验采用单因素试验和正交试验对微波法提取石榴皮中总黄酮的工艺进行研究，并测定总黄酮含量，旨在为石榴皮的进一步开发利用以及质量标准的改进提供参考依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

TV-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司），微波催化合成/萃取仪（祥鹄科技），KDC-1042低速离心机（科大创新股份公司中佳分公司）。

1.2 试药

石榴皮药材购自唐山市医药公司药材站，产地四川，经河北联合大学药学院生药教研室鉴定为石榴科石榴的的干燥果皮。芦丁对照品购自原中国药品生物制品检定所，批号100080-200707。乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为国产分析纯。

2 实验方法和结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取120℃干燥至恒重的芦丁对照品（作为黄酮标准对照品）0.010 7 g，置于50 mL量瓶中，加适量60%乙醇，于水浴上微热溶解，放冷，稀释至刻度，摇匀，配置成0.214 mg/mL的对照品溶液。

2.2 检测波长的确定

吸取芦丁对照品溶液7.5 mL置于50 mL量瓶中，分别加5%亚硝酸钠1 mL，摇匀，放置6 min；加10%硝酸铝 1 mL，摇匀，放置6 min；加4%氢氧化钠10 mL，摇匀，并用60%乙醇定容，摇匀，放置15 min显色[3]。于紫外可见分光光度计上在200～700 nm波长范围内进行扫描。结果表明，芦丁在501 nm下有最大吸收，故选其作为测定波长。

2.3 总黄酮标准曲线的绘制

精密量取芦丁对照品溶液 0，2.5，5.0，7.5，10.0，12.5 mL置于50 mL量瓶中，按照2.2项下方法显色，在501 nm处测定溶液的吸光度（A）值，以A值对质量浓度（C）进行线性回归分析，表明芦丁在0.010 7～0.053 5 mg/mL质量浓度范围内有良好的线性关系。回归方程为

A=14.075 C－0.037 2

r=0.999 8（n=5）。

2.4 单因素试验

2.4.1 乙醇溶液体积分数的选择 精密称定4份石榴皮粉末各 2.0 g，在料液比 1∶20，微波功率500 w，乙醇体积分数分别为 20%，40%，60%，80%条件下，作用1 min，间歇提取3次。 在转速2 000 r/min条件下进行低速离心5 min，取上清液置于100 mL量瓶中，并用60%乙醇定容，摇匀。

精密量取上述量瓶中溶液各2 mL，置于50 mL量瓶中，按照2.2项下方法显色，在501 nm处测定A值，结果见图1。

图1 乙醇体积分数对总黄酮提取的影响

随着乙醇体积分数的增加，A值增加。但当乙醇体积分数超过60%后，A值有所下降。说明体积分数60%的乙醇溶液相对其他浓度能更好地提取出石榴皮中的黄酮类化合物。

2.4.2 微波时间的选择 精密称定4份石榴皮粉末各 2.0 g，在料液比 1∶20，微波功率 500 w，乙醇体积分数为 60%条件下，分别作用 60，90，120，150 s，间歇提取3次，按照2.4.1项下步骤配制供试品溶液并显色测定，结果见图2。

图2 微波时间对总黄酮提取的影响

随着微波时间的增加，A值增加。在120 s时达到最大值，之后随时间增加A值反而下降。说明微波作用120 s提取石榴皮中的总黄酮较为适宜。

2.4.3 料液比的选择 精密称定4份石榴皮粉末各2.0 g，在微波功率500 w，乙醇浓度为60%，料液比分别为 1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 条件下，作用1 min，间歇提取3次。按照2.4.1项下步骤配制供试品溶液并显色，结果见图3。

图3 料液比对总黄酮提取的影响

可见，料液比为1∶20时 A值最大，随料液比增高，A值反而下降，说明提取率有所降低。

2.4.4 微波功率的选择 精密称定4份石榴皮粉末各2.0 g，在乙醇浓度为60%，料液比为1:20，微波功率分别为 300，400，500，600 w 条件下，作用1 min，间歇提取3次。按照2.4.1项下步骤配制溶液并显色，结果见图4。

可见，随着微波功率的增加，A值无明显变化（P＞0.05），说明微波功率对石榴皮中总黄酮的提取无明显影响。

图4 微波功率对总黄酮提取的影响

2.5 正交试验

通过单因素试验对上述不同提取工艺参数进行了初步的筛选；为确定最佳提取工艺，同时进行了正交试验。参照单因素试验结果，可知微波功率对石榴皮中总黄酮的提取无显著影响，故进行正交试验时可考虑忽略此因素的影响。因此设计乙醇溶液体积分数（A）、微波作用时间（B）及料液比（C）3个影响因素，在各自的不同水平进行正交试验[4]，实验设计及方差分析结果见表 1，2，3。

方差分析结果显示，因素A具有显著性差异（F 比＞F0.05，2.2=19.0），而因素 B，C 不具有显著性（F 比＜F0.05，2.2=19.0），即乙醇体积分数对总黄酮提取具有显著的影响。

由表2，3结果可知，A和C对石榴皮中总黄酮的提取有较大影响，B影响较小。故最佳提取工艺为A2B3C3。即乙醇体积分数为 60%、料液比1∶25、微波时间为120 s。

表1 正交试验因素水平

2.6 样品含量测定

精密称定5份石榴皮粉末各2.0 g，在料液比1∶25，微波功率 500 w，乙醇浓度为 60%条件下，分别作用 120 s，间歇提取3次。2 000 r/min条件下进行低速离心，离心5 min，取上清液置于100 mL量瓶中，并用60%乙醇定容，摇匀，得供试品溶液。

表2 L9（34）正交试验设计方案及结果

表3 正交试验结果方差分析

精密量取上述量瓶中溶液各1 mL，置于50 mL量瓶中，按照2.2项下方法显色，在501 nm处测定A值，见表4。

表4 样品含量测定结果（n=5）

2.7 精密度试验

精密称定石榴皮粉末2.0 g，按2.6项下方法制备供试品溶液，精密量取上述溶液1 mL，置于50 mL量瓶中，按照2.2项下方法显色，于501 nm处连续测定A值6次，RSD为0.205%，说明供试品溶液精密度良好。

2.8 稳定性试验

精密量取含量测定项下制备的同一份供试品溶液每隔10 min测定1次A值，结果在 40 min内A值无显著变化，RSD为2.34%，说明供试品溶液在40 min内稳定性较好。

2.9 加样回收率的测定

取已知含量的石榴皮粉末5份，每份约2.0 g，精密称定。按2.6项下方法制备供试品溶液。精密量取上述供试品溶液各1 mL，置于50 mL容量瓶中，分别加入5 mL芦丁对照品溶液，按照2.2项下方法显色，于501 nm处分别测定A值，计算回收率，见表 5。

表5 加样回收率试验结果（n=5）

3 讨论

3.1 检测波长的选择

取一定浓度的芦丁对照品溶液，采用硝酸铝显色法，在200～700 nm波长范围内进行光谱扫描，结果在370 nm附近和501 nm处分别有最大吸收，但在501 nm处光谱峰峰形更理想，而在370 nm附近光谱峰较为杂乱，故选定501 nm为检测波长。

3.2 黄酮类成分提取方法的选择

黄酮类成分常用加水煎煮法、碱提酸沉法或乙醇、甲醇浸泡提取法,费时、费工、提取率低。微波提取法利用微波能迅速破坏细胞壁加快活性成分溶出，使许多难溶性物质在微波电磁场的作用下得到较好溶解，从而提高了提取速度和得率[5]，因此与常规提取方法相比具有选择性强，耗时短，能耗低，排污量少[6]，溶剂用量少，提取效率高，有效成分破坏少等优点，故本研究采用微波提取法。

3.3 总黄酮含量测定方法的选择

分光光度法一般用于总黄酮含量测定，由于其他组分干扰，影响测定的准确性，多需进行显色测定。利用黄酮类与金属盐类试剂显色，再进行光谱测定，能显著提高含量测定的选择性及灵敏度[7]。故本实验选择硝酸铝显色法，方法准确可靠。刘苑等[8]采用直接紫外分光光度法，以芦丁为对照品，于360.5 nm处测定了毛茛药材不同萃取部位的总黄酮含量，平均回收率均在95%～105%范围内。薄层扫描法和高效液相色谱法是测定单体黄酮有效方法[7]。如黄芩苷、槲皮素和葛根素等均为黄酮类主要代表成分，有报道[9]采用反相高效液相色谱法测定五味安神颗粒中葛根素的含量，方法灵敏度高，重复性好，简便准确，平均回收率为100.1%。罗爱勤等[10]采用HPLC测定肾石通颗粒中槲皮素含量，方法灵敏、准确，平均回收率为98.8%，可作为肾石通颗粒的质控方法。因此对含有黄酮类成分的中药材和制剂，可按要求选择不同方法测定总黄酮或单体黄酮进行质量控制。

本研究确定了微波提取法提取石榴皮药材中总黄酮的最佳提取工艺，测定了总黄酮含量，为石榴皮开发利用和药材的质量标准制定提供了参考依据，且该方法具有良好的应用前景。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（2010年版）一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：87.

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[6] 杨铭，余林，陈润升，等.微波场协同提取女贞子总黄酮的研究[J].时珍国医国药，2009，20（1）：80-81.

[7] 蔡宝昌.中药制剂分析[M].北京：高等教育出版社，2007：132-133.

[8] 刘苑，张兴,谭毓治，等.紫外分光光度法测定毛茛不同部位总黄酮的含量[J].广东药学院学报，2010，28（2）：1-3.

[9] 向泉深，聂惠君，吴彩娟.反相高效液相色谱法测定五味安神颗粒中葛根素的含量[J].中国执业药师，2008，5（6）：29-30.

[10] 罗爱勤，陈泽锋.HPLC法测定肾石通颗粒中槲皮素的含量[J].中国执业药师，2012，9（3）：17-19.