CD68在胃癌组织中表达的意义及对肿瘤复发的影响

杨卫军，杨 霞，尹家俊，王亚东，董浩林，吴正阳

（1.贵阳市第一人民医院 普外科，贵州 贵阳550002；2.第三军医大学 免疫教研室，重庆400030；3.大连大学附属中山医院 普外科，辽宁 大连116001）

肿瘤组织内及其周围浸润的巨噬细胞称作肿瘤相 关 巨 噬 细 胞 （tumor－associated macrophages，TAMs），以往认为在肿瘤内浸润的巨噬细胞越多，肿瘤进展越慢，预后越好。近年来的研究表明，多种肿瘤内浸润的肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤病人预后不良的指标［1］。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）参与肿瘤发展的多个环节，并在促进血管和淋巴管生成过程中起重要作用［2］。目前关于肿瘤相关巨噬细胞在不同分期的胃癌中浸润以及对胃癌术后复发率的影响的研究尚少，本研究采用免疫组化方法对52例胃癌组织进行CD68染色以检测、比较肿瘤相关巨噬细胞在不同分期的胃癌组织的浸润，并通过术后随访比较肿瘤三年内的肿瘤复发率，进一步了解肿瘤相关巨噬细胞对胃癌预后的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 胃癌组织标本取材于重庆肿瘤医院2009年－2010年52例胃癌手术病人，年龄28岁－76岁，男性36例，女性16例。术前均未行放化疗以及其他抗肿瘤治疗。所有病人均行D2胃癌根治术，术后记录病理类型、临床分期、分化类型。所有病人术后均行XELOX方案化疗6个周期。术后通过住院、门诊复诊以及电话联系方式对病人随访3年。

1.1.2 CD68抗体免疫组化试剂盒购自abcam公司。

1.2 方法

取术后胃癌组织经10%甲醛固定，石蜡包埋切片。常规脱蜡至水，严格按试剂盒说明书操作，3%过氧化氢避光孵育10min消除内源性过氧化物酶；PBS冲洗，微波抗原修复10min，滴加血清工作液，室温孵育15min封闭非特异性抗原；滴加一抗后置入冰盒4℃过夜。用PBS代替一抗作阴性对照。PBS洗3次，滴加二抗，室温 孵育30min，PBS洗涤，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育15min，PBS洗涤，DAB显色，蒸馏水终止，苏木素复染，酒精梯度脱水、二甲苯透明，树胶封片。

1.3 结果判定

CD68在巨噬细胞的胞浆内表达，胞浆含清晰的黄褐色或黄色颗粒状者为阳性。观察胃癌组织切片中TAM最密集的区域，选择5个区域在400倍视野下计数并取其平均值即为该组织切片中的肿瘤相关巨噬细胞浸润的数量［3，4］。取本组所有胃癌病人的TAM浸润的中位数作为区分高密度和低密度的分界点［5］，将52例胃癌病人分为高密度组和低密度组。

1.4 统计学方法

应用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析，计量数据以±s表示，多组比较采用单因素方差分析；计数资料比较采用χ2检验及Fisher精确概率法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD68在胃癌组织中的表达情况

本组52例胃癌组织标本均见不同程度的CD68阳性表达，主要集中在胃癌间质内，即TAM主要在胃癌组织的间质中浸润。52例标本TAM浸润的范围为70.28±29.34/HP，浸润的密度为23－154/HP，平均70.3/HP，中位数63/HP。如图1所示。

图1 TAM在胃癌组织中的浸润（CD68，×400）

2.2 不同 分期胃癌组织中 浸润的比较

如表1所示，本组病例中TAM在Ⅰ－Ⅱ期共17例，TAM 浸润的密度为41.02±8.47/HP；Ⅲ期28例，TAM 浸润的密度为74.10±13.49/HP；Ⅳ期7例，TAM 浸润的密度为126.10±13.35/HP。三者比较有明显差异（P＜0.05）。

2.3 TAM在胃癌组织有淋巴结转移组与无淋巴结转移组中浸润的比较

本组病例有13例标本无淋巴结转移，TAM浸润的密度为38.36±7.87/HP；而有淋巴结转移者39例，TAM 浸润的密度为81.78±25.68/HP，两者比较有明显差异（P＜0.05）。见表1。

表1 TAM在52例胃癌组织中浸润情况

2.4 胃癌组织高密度TAM浸润与低密度浸润对胃癌术后复发率的影响

本组52例胃癌病人中，术后一年的总复发率为21.15%，术后二年累计复发率为42.31%，术后三年累计复发率为57.69%。以52例标本TAM浸润密度的中位数63/HP为分界点，分为高密度组27例，低密度组25例，高密度组在术后1年、2年、3年的累计复发率明显高于低密度组（P＜0.05）。如表2所示。

表2 胃癌组织中不同密度浸润的TAM对术后累计复发率的影响

3 讨论

肿瘤组织中浸润的炎细胞以巨噬细胞为主，肿瘤组织中浸润的肿瘤相关巨噬细胞曾被认为是机体的抗肿瘤免疫反应的表现。近年的研究认为肿瘤组织中浸润的炎细胞可能促进肿瘤的发生、发展。有研究表明，高密度浸润的肿瘤相关巨噬细胞与病人的不良预后相关［1］。宋宇峰等的研究［6］发现口腔鳞癌中浸润的巨噬细胞较正常组织中明显增多。但目前对恶性肿瘤组织内肿瘤相关巨噬细胞增多的机制尚不明了。

本次研究肿瘤相关巨噬细胞在不同TNM分期的胃癌组织中浸润的密度上有明显差异，肿瘤分期越晚其内浸润的TAM密度越高。进一步提示胃癌组织中浸润的TAM密度越高预示着胃癌的恶性程度越高，病人的肿瘤分期越晚，TAM参与了促进胃癌进展，TAM与胃癌病人不良预后相关。研究中发现，有淋巴结转移组的TAM密度明显高于无淋巴结转移组，也说明了高密度的TAM在胃癌组织中浸润能促进胃癌淋巴结的转移。在对胃癌组织中浸润的高密度TAM与低密度TAM对胃癌术后复发率的研究中发现，胃癌病人高密度组在术后一年、二年、三年的累计肿瘤复发率明显高于低密度组。胃癌的术后复发率越高意味着病人术后生存率越短。这进一步说明胃癌组织中高密度浸润的TAM能促进肿瘤的复发，高密度浸润的TAM是胃癌病人预后不良的重要因素。

现有的研究表明，肿瘤相关巨噬细胞来源于外周血循环中的单核细胞，是在多种趋化因子的作用下迁移到肿瘤间质中然后分化为肿瘤相关巨噬细胞。巨噬细胞分为M1型和M2型。M1型巨噬细胞具有递呈肿瘤抗原和吞噬肿瘤细胞等细胞毒性效应；M2型巨噬细胞可通过其复杂的自分泌、旁分泌途径，在肿瘤的侵袭和转移中发挥重要作用，与肿瘤的恶性增殖及凋亡密切相关［7］。Melichar［8］发现上皮性恶性卵巢癌病人的腹水中巨噬细胞与外周血中的巨噬细胞在表型与功能上不一致。冯红超等的研究［9］提示在缺氧的环境下单核/巨噬细胞分泌的V EGF的能力增加，推测肿瘤相关巨噬细胞促进肿瘤的血管生成而更多地参与了肿瘤的生长和转移。本次研究发现胃癌组织分期越晚其内浸润的巨噬细胞越多，提示在胃癌分期晚者其内增多的巨噬细胞主要是M2型巨噬细胞，而这种对胃癌细胞丧失杀伤、吞噬功能的免疫细胞在肿瘤微环境中促进了胃癌的进展和转移，最终导致胃癌病人术后的复发率增高。

胃癌是消化道常见的恶性肿瘤，胃癌术后复发是病人最常见的致死原因。外科手术以及术后化疗并不能明显的有效降低病人的术后复发率和延长生存率。因此，揭示胃癌组织中肿瘤相关巨噬细胞浸润的机制以及巨噬细胞表型转化的机制，如何调控M1型巨噬细胞表型向M2型巨噬细胞的转化以及抑制M2型巨噬细胞的功能，不但对延长胃癌病人的生存率和减少复发率有重要意义，也将为胃癌病人的免疫治疗提供一个新的途径。

［1］Takanami I，Takeuchi K，Kodaira S.Tumor－associated macrophage infiltration in pulmonary adenocarcinoma：association with angiogenesis and poor prognosis［J］.Oncology，1999，57（2）：138.

［2］Coffelt S B，Hughes R，Lewis C E.Tumor－associated macrophages effectors of angiogenesis and tumor p rogression［J］.Biochim Biophys Acta，2009，1796（1）：11.

［3］彭 娟，丁 童，郑利民，等.肿瘤相关巨噬细胞对鼻咽癌进展和预后的影响［J］.癌症，2006，25（11）：1340.

［4］Lindsay TH，Jonas BM，Sevcik MA，et al.Pancreatic cancer pain and its correlation with changes in tumor vasculature，macrophage infiltration，neuronal innervations，body weight and disease progression［J］.Pain，2005，119（1－3）：233.

［5］万 挺，刘继红，郑利民，等.肿瘤相关巨噬细胞在晚期上皮性卵巢癌组织中的浸润及其与预后的关系［J］.癌症，2009，28（3）：323.

［6］宋宇峰，冯红超，温玉明.口腔鳞状细胞癌中巨噬细胞浸润和肿瘤生长、转移的关系［J］.中华口腔医学杂志，2005，40（5）：385.

［7］Chen JJ，Lin YC，Yao PL，et al.Tumor－associated macrophages：the double－edged sword in cancer p rogression［J］.J Clin Oncol，2005，23（5）：953.

［8］Melichar B，Savary CA，Patenia R.Phenotype and antitumor activity of ascetic fluid monocytes in patients with ovarian carcinoma［J］.Int J Gynecol Cancer，2003，13（4）：435.

［9］冯红超，彭江帆，马 洪，等.口腔癌组织中缺氧微环境对单核/巨噬细胞分泌 V EGF影响的实验研究［J］.重庆医学，2010，39（17）：2244.