HPLC法测定浮萍中芹菜素的含量

苏春英，苏本华，孙静

(1.济南市皮肤病医院，山东 济南 250001;2.山东大学附属省立医院，山东 济南 250021;3.山东中医药大学，山东 济南 250355)

浮萍为浮萍科植物紫萍［Spirodela polyrrhiza(L.)Schleid.］的干燥全草。味辛，性寒，归肺、膀胱经，具有发汗解表、利水消肿、清热解毒之功效。主要含有芹菜素、芹菜素－7－单糖苷、木犀草素、木犀草素－7－单糖苷、牡荆素、荭草素等黄酮类化合物，β－胡萝卜素、叶黄素、环氧叶黄素等类胡萝卜素类成分，亚麻酸、棕榈酸、亚油酸等脂肪酸类成分及以亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸为主要组成的蛋白质类成分。具有强心、收缩血管、升高血压、抗感染、利尿、促进黑素细胞生长、抗凝血等多方面的药理作用。临床主要用于风热表证、麻疹不透、隐疹瘙痒、水肿、癃闭、疮癣、丹毒、烫伤等证的治疗。2010年版《中国药典》仅收载性状、薄层色谱鉴别和水分检查，无含量测定标准。

近年来，关于浮萍的研究多见于临床应用等方面，有关浮萍中多糖的含量测定方法及本草考证、紫外鉴别、生药学研究等已有报道［1－3］，本文首次采用HPLC法测定浮萍中芹菜素的含量，为浮萍药材的质量控制和合理利用提供实验依据。

1 仪器与试药

塞多利斯BP211D型电子天平(德国sartorius);TU－1810型紫外－可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);高效液相色谱仪(Waters Alliance 2695);二极管阵列检测器(Waters PDA 2996);色谱工作站(Waters Empower)。

芹菜素对照品(批号111901－201001);水为超纯水;甲醇为色谱纯;其余试剂均为分析纯。

浮萍样品，经山东中医药大学石俊英教授鉴定为浮萍科植物紫萍［Spirodela polyrrhiza(L.)Schleid.］的干燥全草。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Phenomenex－ODS柱(4.6mm ×250mm，5μm);柱温:40℃;检测波长:340nm;PDA色谱峰光谱采集范围:300～400nm;流动相:甲醇 －0.2%磷酸溶液(55:45);流速:1.0ml/min;进样量:10μl;理论塔板数按芹菜素峰计算应不低于3 000。

2.2 检测波长的选择 取芹菜素对照品，用适量甲醇溶解，按分光光度法，在300～400nm之间扫描，在340nm处芹菜素有最大吸收且峰形良好，故确定检测波长为340nm。

2.3 供试品溶液色谱峰纯度检查 鉴于中药材难以制备阴性对照，故选用PDA检测器对供试品溶液色谱峰纯度进行检查。实验结果显示，在芹菜素保留时间处，供试品溶液与对照品溶液的光谱图完全一致，表明在芹菜素保留时间处供试品溶液无其它干扰杂质。

2.4 线性关系考察 取五氧化二磷干燥器中减压干燥48h以上的芹菜素对照品约25mg，精密称定，用甲醇溶解并定容至100ml，作为芹菜素对照品贮备液。分别精密量取对照品贮备液 1、2、4、8、10ml，用甲醇稀释并定容至25ml，作为5个浓度的芹菜素对照品溶液，分别精密吸取10μl，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以进样量C为横坐标，芹菜素吸收峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程为:A=20 456+3 323 637C(r=0.999 9)。表明在0.101 68 ～1.016 8μg范围内，芹菜素进样量与吸收峰面积之间线性关系良好。

2.5 精密度实验 取浓度为20.336ug/ml同一芹菜素对照品溶液，连续进样5次，在上述色谱条件下测定，吸收峰面积分别为:702 833，704 665，707 534，705 509，700 842，平均值 704 277，RSD(%)=0.36%。表明仪器的精密度良好。

2.6 稳定性实验 取同一供试品溶液，分别于制备0、1、2、4、8、10h后 测 定，吸 收 峰面 积 分别 为:1 285 737，1 285 033，1 278 138，1 271 055，1 275 826，1 254 859，平均值 1 275 108，RSD(%)=0.89%。表明在制备后10h内供试品溶液基本稳定。

2.7 重复性实验 取同一样品，平行制备5份供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算芹菜素的含量分别为0.944mg/g， 0.936mg/g， 0.932mg/g， 0.942mg/g，0.946mg/g，平均值 0.94mg/g，RSD(%)=0.62%。表明方法的重现性良好。

2.8 加样回收率实验 精密称取已知芹菜素含量的样品6份，分别精密加入一定量的对照品，按样品测定方法处理并测定，计算加样回收率，结果见表1。芹菜素的平均加样回收率98.91%，RSD(%)=1.07%。表明测定方法准确、可靠。

表1 芹菜素含量测定加样回收率实验结果(n=6)

2.9 样品测定 取过三号筛的样品粉末1g，精密称定，置索氏提取器中，加石油醚(60～90℃)100ml，回流提取至提取液无色，弃去溶剂，药渣挥干石油醚，加甲醇100ml回流提取2h，滤过，提取液水浴蒸干，残渣精密加入甲醇－25%HCL溶液(4:1)混合液25ml，称重，加热回流30min，放冷，用甲醇补足损失的重量，滤过，取续滤液作为供试品溶液。按上述色谱条件，分别精密吸取对照品和供试品溶液各10μl，测定，计算。结果见图1，表2。

图1 芹菜素含量测定高效液相色谱图

表2 浮萍中芹菜素含量测定结果(n=3)

3 讨论与小结

3.1 由于浮萍中成分复杂，含有脂肪酸、叶绿素等脂溶性组分干扰芹菜素的测定，因此对样品先进行了脱脂处理。根据文献报道［4］，芹菜素在浮萍中主要以苷的形式存在，因此将样品水解以后进行测定。供试品溶液制备过程中对提取时间进行了比较，提取2h以后，延长提取时间，测得芹菜素含量不再增加，故确定提取时间为 2h。水解时间比较了 10min、20min、30min、40min，结果表明，水解30min测得芹菜素含量最高，故确定水解时间为30min。

3.2 HPLC法测定浮萍中芹菜素的含量，操作简便、准确、灵敏度高，通过稳定性、重复性、加样回收率等方法学考察表明，符合含量测定的要求。建议《中国药典》中增加浮萍的含量测定项，以更好的控制药材的质量。

［1］周菁，王伯初，王阳.浮萍多糖总糖含量测定与评价［J］.重庆大学学报(自然科学版)，2005，28(10):71 －72.

［2］陈桂荣，罗集鹏.浮萍的本草考证与紫外光谱法鉴别［J］.中药材，2005，28(6):18 －19.

［3］胡本祥，郑俊华，杨树荣.浮萍的生药形态及组织学研究［J］.陕西中医学院学报，2002，25(3):31 －32.

［4］凌云，何板作，鲍燕燕，等.浮萍的化学成分研究［J］.中草药，1999，30(2):24－26.