山东省鸡源空肠弯曲菌喹诺酮类药物耐药机制研究

陈 霞，汪 洋，骆鹏杰，李 娟，吴聪明

（1．中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 传染病预防控制国家重点实验室 感染性疾病诊治协同创新中心，北京 昌平102206；2．中国农业大学动物医学院，北京 海淀100193；3．国家食品安全风险评估中心，北京 朝阳100022）

空肠弯曲菌（下称空弯）是一种重要的食源性致病菌，是动物体内的正常菌群［1－2］，可造成人类肠炎的暴发流行和食物中毒［3］。我国对于食品源动物空弯的研究尚在起步，但随着国际贸易的繁荣和我国对食品安全的日益重视，食品动物源空弯病的流行分布和耐药性研究愈来愈受到广泛的重视。喹诺酮类药物由于其高效、广谱的抗菌特点，在畜牧养殖业曾长期、广泛地使用，不少研究也报道了不同细菌对于其日趋严重的耐药情况。

我国食品动物源空弯喹诺酮耐药性的研究较少［4］。本文通过对采集自2008年山东省的鸡源空弯进行喹诺酮类耐药机制的阐述，为我国动物源性空弯耐药性现状的了解和评估提供可靠的数据，对兽医及人医领域有着十分重要的公共卫生意义。

1 材料与方法

1．1 菌株背景 202株空弯采集于2008年山东省五地的大型综合肉鸡屠宰场，其背景信息已有文章详述［4］，归纳如下：202株空弯分离株对受试的喹诺酮类药物均呈现非常高的耐药率和耐药水平，超过98%的菌株对喹诺酮耐药。

1．2 主要试剂 普通PCR用2×TaqPCR MasterMix，购自天根生化科技（北京）有限公司；测序PCR用PremixExTaq＠version 2．0，购自 TaKa－Ra宝生物工程（大连）有限公司。

1．3 可移动喹诺酮耐药基因的筛查 按照已有文献对常见的7种可移动喹诺酮耐药基因进行筛查［5］。

1．4gyrA和gyrB基因相关区域研究及parC的测定 采用错配扩增PCR（MAMA PCR）对所有空弯的gyrAQRDR 的 C－257－T 突变进行检测［6］，利用普通PCR对parC基因进行测定［7］。

挑选环丙沙星（喹诺酮类代表药物）不同耐药水平空弯进行gyrA和gyrB相关区域测序，使用引物如文献所述［8－9］。

2 结果

2．1 可移动喹诺酮耐药基因的筛查情况 通过对202株空弯进行7种常见的喹诺酮耐药基因筛查，未发现在受试空弯中存在任何可移动的喹诺酮耐药基因。

2．2 QRDR的突变测定及对parC基因的测定结果 对202株空弯进行gyrAQRDR特异性点突变C－257－T的检测，发现除龙口地区一株环丙沙星低水平耐药（MIC＝8μg／mL）空弯外，所有环丙沙星耐药空弯均存在此点的突变，质控菌株及敏感菌不存在此突变。

在gyrA相关区域测序，发现93株环丙沙星耐药弯曲菌存在C－257－T的点突变，低耐、敏感空弯及质控菌株ATCC 33560不存在该突变。另外，环丙沙星耐药空弯中存在多个沉默突变，未见其他有义突变。在gyrA相关区域中，存在最多的沉默突变是C－243－T和 C－357－T，存在于除质控菌株 ATCC 33560外的所有受检弯曲菌中；其他常发生的沉默突变包括 C－360－T、C－471－T、C－483－T、A－608－G、C－622－T。较少发生的沉默突变 T－603－C（n＝7，邹平）、A－624－G（n＝2，龙口低耐及敏感菌株）和 C－645－T（n＝2，龙口低耐及敏感菌株），见表1。

gyrB基因相关区域测序显示不存在有义突变。存在最多的位点沉默突变是C－1308－T和C－1360－T，分别有23株和22株；C－1467－T发生在采集自邹平的2株菌株中；G－1383－A，C－1404－T和C－1413－T突变发生在同一株采集于邹平的菌株中；另有16株环丙沙星耐药空弯未检测到任何突变，见表1。

对所有空弯进行parC的扩增，但并没有成功。

表1 空弯gyrA和gyrB相关区域点突变情况

3 讨论

细菌喹诺酮耐药性和耐药基因的贡献关系密切。如存在于肠杆菌科细菌的qnr、qepA等，它们可多种细菌间广泛传播，帮助低耐细菌数量增加从而达到出现突变所需要的浓度，引起高水平耐药［5］，本研究检测了7种喹诺酮耐药基因，但并没有任何发现，这和之前的研究结果相同［10］。

空弯对喹诺酮类药物的耐药与gyrA基因上QRDR特异性点突变密切相关［10－12］。本研究经检测均存在gyrA上QRDR的热点突变C－257－T。该点突变引起的Thr－86－Ile转换能够造成空弯对环丙沙星的高水平耐药。另外，还有其他一些介导中介水平的喹诺酮耐药的单突变如或双重突变［9－10］在本研究中未有发现。本研究中除2株空弯（MIC＝8 μg／mL）外，其他环丙沙星耐药空弯对环丙沙星的MIC≥32μg／mL［4］，未发现除C－257－T外的其他相关点突变，暗示在gyrAQRDR的C－257－T与弯曲菌环丙沙星高水平耐药表型有明显关系。

本研究中还通过测序在相关序列中发现多个沉默突变。部分沉默突变仅存在于一个或两个地区的菌株中，这提示在同一地区中流行着具有相同沉默突变的gyrA、gyrB基因亚型。

有报道parC基因的突变能够介导高水平喹诺酮耐药［7］，本研究按照文献引未能成功扩增parC基因，这和很多不同学者都没能成功检测出弯曲菌中存在parC，不能进行相关后续试验［10］的报道结果一致，提示绝大多数空弯中不存在ParC。

综上，本研究通过对采集自我国山东地区的鸡源空弯进行喹诺酮类耐药机制探讨，确定菌株的高水平喹诺酮耐药表型与gyrA上QRDR的热点突变C－257－T密切相关。存在于gyrA和gyrB基因上的部分沉默突变有地域性流行特点。作为一种动物体内共生，可治人类疾病的细菌，空弯耐药性应引起足够重视，加强对其的耐药性监控和耐药性机制研究，对于兽医、人医了解空弯耐药现状，防控其传播和流行有着重大的公共卫生意义。

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