HPLC－PDA法测定黄芪多糖注射液中非法添加利巴韦林的试验

2013-09-23郝利华毕言锋郭桂芳刘自扬万仁玲

中国兽医杂志 2013年2期

郝利华，毕言锋，郭桂芳，刘自扬，万仁玲

（中国兽医药品监察所，北京海淀100081）

黄芪多糖注射液具有增强机体免疫力等作用，在兽医临床广泛应用。利巴韦林为人用抗病毒药，移植兽用缺乏科学数据，用于动物疫病不但给疫病防控带来不良后果，而且影响疫病防控政策的实施，农业部于2005年10月《农业部第560号公告》中明确规定禁止兽用。根据目前兽药市场反应的情况，黄芪多糖注射液中有违规添加利巴韦林现象。本试验旨在建立黄芪多糖注射液中非法添加利巴韦林的HPLC－PDA定性、定量检查方法，又用质谱法对测定结果进行确证。试验结果表明，本方法简便、快速、准确、可行，为兽药监管提供科学依据。

1 仪器与试药

1．1 仪器高效液相色谱仪 Waters 2695，二极管阵列检测器2998（PDA），美国Waters公司。

精密天平AE240精度0．01mg梅特勒精密仪器厂

1．2 试药利巴韦林对照品：中国药品生物制品检定所，批号：629－200202；供试品：市售黄芪多糖注射液；黄芪多糖提取物：中国兽医药品监察所，含量25%（以葡萄糖计）。

2 试验方法

2．1 溶液制备对照品溶液：取利巴韦林对照品15mg，精密称定，置50mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取5mL至25mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

阴性对照溶液：取黄芪多糖提取物4．0g，加水100mL，即得［1］。

供试品溶液：精密量取供试品1mL，置100mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取5mL置25mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。

2．2 色谱条件［2］采用资生堂利巴韦林专用柱（CAPCELL，PAK，Scx，UG80，4．6×250mm，5 μm）；以水（用硫酸调节pH 值至2．5±0．1）为流动相；采用二极管阵列检测器，采集波长范围为190 nm～400nm，分辨率为1．2nm，检测波长207nm；进样量20μL，流速0．3mL／min。理论板数按利巴韦林峰计算应不低于3 000。

2．3 方法学考察

2．3．1 样品本底及干扰精密量取对照品溶液和阴性对照溶液各溶液20μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图和光谱指数图，测定黄芪多糖成分对测定结果是否产生干扰。

结果见图1、图2，黄芪多糖注射液本底对利巴韦林测定不产生干扰。

2．3．2 线性关系考察取利巴韦林对照品30mg，置50mL量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1、3、5、7、9mL于25mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，测定。按利巴韦林峰面积与对应的浓度作标准曲线，并计算回归方程和相关系数。利巴韦林回归方程为y＝46 083x＋106，R2＝0．999 9。表明利巴韦林在24μg／mL～216μg／mL浓度范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系。

2．3．3 检测限与定量限黄芪多糖储备液：取阴性对照溶液0．15mL［2］置50mL量瓶中，加水至刻度，摇匀。

检测限溶液制备：取2．1对照品溶液适量（可适当稀释）、加黄芪多糖储备液5mL于25mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，测定。光谱指数图失真前的浓度为本法的检测限，S／N≥10的浓度为定量限。该色谱条件下利巴韦林检测限为2μg／mL，定量限为6μg／mL。

图1 阴性对照溶液光谱图、色谱图

图2 利巴韦林对照品光谱图、色谱图

2．3．4 回收率试验取利巴韦林对照品12mg、15 mg、18mg，精密称定，置50mL量瓶中，分别加黄芪多糖注射液各0．15mL，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取5mL于25mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，按上述色谱条件测定，每个浓度测定3份平行样。回收率结果见表1。

2．4 供试品测定取市售黄芪多糖注射液25批（不同厂家），按上述色谱条件测定。结果见表2。

2．5 质谱确证条件［3］色谱条件：Waters ACQUITY UPLC液相色谱仪；ACQUITY C18色谱柱（100 mm×2．1mm i．d．，1．7μm）；流速0．3mL／min；柱温35℃；流动相A为0．1%甲酸乙腈溶液，流动相B为0．1%甲酸水溶液；梯度洗脱程序：0～0．5min，A相比例为2%；0．5～3min，A相比例由2%线性变化至20%。进样体积2μL。

质谱条件：Waters HDMS四级杆－飞行时间质谱仪（Q－TOF MS），离子源为电喷雾正电离模式（ESI＋），毛细管电压3．0kV，锥孔电压20V；采用碰撞能量梯度（MSE）功能同时采集MS和 MS2信息，低碰撞能设为4V，高碰撞能梯度范围设为10～20V；离子源及脱溶剂气温度分别为120℃和350℃；脱溶剂化气体流速设为650L／h。TOF MS质量采集方式为全扫描，范围为m／z 50至300Da，样品分析前用甲酸钠溶液进行质量数校正。另外，采用亮氨酸－脑啡肽溶液（LE，m／z 566．2771）为Lock mass实时校正精确质量数。

表1 利巴韦林回收率

表2 黄芪多糖注射液中利巴韦林含量测定结果

3 结果与分析

通过对比对照品和供试品色谱图的保留时间，发现在检测的25批黄芪多糖注射液中，3批添加了利巴韦林，对照品溶液中的利巴韦林与供试品溶液中的添加物质PAD光谱一致，检出波长均为206 nm，色谱保留时间一致，证明其中添加了利巴韦林［4］，见图3。

图3 HPLC－PDA光谱指数图（上）及色谱图（下）

为了进一步确证检出利巴韦林，又采用了超高效液相色谱－四级杆－飞行时间质谱进行分析，对比对照溶液和样品溶液的保留时间（RT）和质谱碎片离子（MS2）。对照品溶液中，利巴韦林（m／z245）的选择离子检测监测色谱图（EIC）和MS2全扫描质谱图见图3（a），其中，RT为1．14min，主要碎片离子有m／z113和 m／z96。供试品溶液中利巴韦林的EIC和 MS2全扫描质谱图见图3（b），其RT和MS2信息与对照溶液完全相同，说明供试品溶液中确实含有利巴韦林，见图4。