软脂酸在体外激活Caspase9和Caspase3引起L02细胞凋亡

屠 迪，邬 静，袁莉芸，文利新，2

（1．湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙410128；2．长沙绿叶生物科技有限公司，湖南 长沙410128）

当前畜牧生产中集约化养殖，饲养密度较高，动物运动量减少，高能量日粮，疫病的流行及饲料添加剂和治疗药物的毒副作用等不良因素都对动物体的能量代谢有不利影响。长期高能量摄入会引起动物肝内多种脂类的蓄积［1－3］，包括甘油三酯（TG）、胆固醇和游离脂肪酸（FFA）等［4］，大量的FFA则具直接的细胞毒性，进而引起肝细胞代谢功能失调和凋亡［5］。当肝细胞脂肪变性时，凋亡细胞数量增加，并可出现血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）升高等生化指标变化。因此有学者将FFA在非脂肪组织中过度沉积引起脂代谢异常而造成的损伤称为脂毒性（Lipotoxicity）；上述过程所引起的细胞凋亡，称为脂凋亡（Lipoapotosis）［6－7］。当肝脏发生脂损伤时会影响肝脏及全身各脏器各种功能生理机能并造成机体代谢紊乱，影响动物的繁殖性能和肉品品质，并使动物抗应激能力、免疫能力下降等容易受到致病因素影响，容易引发疾病。本文以软脂酸（Palmitic acid，PA）对人肝细胞L02细胞进行处理诱导其发生脂凋亡，并对此过程中Caspase3与Caspase9信号的作用进行研究，从而对脂凋亡发生机制进行探索。

1 材料与方法

1．1 材料 人L02肝细胞系，购自中南大学湘雅医学院实验中心；RPMI1640培养基为GIBCO产品；胎牛血清（FBS）为杭州四季青公司产品；兔抗人Caspase3抗体货号sc－8355和兔抗人Caspase 9抗体货号Sc－1226为北京中杉金桥生物技术有限公司产品；兔抗人β－actin抗体货号bs－0061R为北京博奥森生物技术有限公司产品；总蛋白试剂盒，货号A006由南京建成生物工程研究所生产；AV／PI流式细胞检测试剂盒由Invitrogen公司生产。

1．2 试验分组 L02细胞系的基础培养基为含有10%FBS的RPMI1640培养基，软脂酸（Palmitic acid，PA）的助溶剂为DMSO终浓度为0．5%。试验细胞共分4组，L02细胞以4×104细胞／mL密度传代培养24h后更换培养基并按照表1所示加入PA，并继续在37℃5%CO2的条件下培养24h以进行后续检测。

表1 L02脂肪变性模型分组

1．3 细胞凋亡检测 试验采用DAPI染色通过形态学对凋亡进行鉴定，并采用AV／PI双染后流式细胞检测为细胞凋亡提供一步的证据。

1．4 Caspase3与Caspase9检测 常规 Western blot操作步骤检测Caspase3与Caspase9，重复3次进行统计分析。

2 结果

2．1 细胞凋亡检测结果 DAPI是一种可以和双链DNA结合的染料，与DNA结合后可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光并以此区别凋亡细胞。DAPI染色结果（图1）显示，未添加PA的对照组低倍镜下观察，几乎未见浓染的细胞核，软脂酸处理后视野中高亮、变形、肿胀等异常形态细胞核清晰可见。对浓染的细胞核进行计数后发现，发生细胞核浓染（“→”所示）的细胞数量随PA剂量的增加而增多。高倍镜下显示大量的细胞核呈现波纹状或呈折缝样外观，部分染色质出现浓缩状态，仅有少数的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。这一结果表明，PA处理24h后可以引起处于早期凋亡阶段的细胞数量显著增加。

图1 DAPI染色鉴定L02细胞凋亡结果40×

AV／PI双染法通过检测细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS），可以快速、灵敏地检测出细胞混合物中凋亡细胞的含量。AV／PI双染后进行流式细胞检测细胞凋亡率，每组重复3次后进行统计分析。试验结果显示，在L02细胞的培养体系中加入PA可以诱导细胞凋亡率的上升，而且PA主要引起处于早期凋亡阶段的细胞数量增加（图6）。总体的细胞凋亡率从对照组的3．6±0．3%上升至18．7±0．9%。

统计结果显示，与对照组相比，30mg／mL的PA可显著诱导L02细胞进入凋亡早期阶段（P＜0．05），PA 50mg／mL组L02细胞凋亡率为极显著（P＜0．01）。上述结果说明，进入早期凋亡阶段L02细胞的数量与PA浓度正相关。

图2 对照组流式细胞检测结果

图3 10mg／mL软脂酸组流式细胞检测结果

图4 30mg／mL软脂酸组流式细胞检测结果

2．2 Caspase3与Caspase9Western blot检测结果Caspase9前体及其激活物的检测结果显示（图7图8），PA并未影响 Caspase9前体（图7）的水平，而Caspase9的激活物的水平（图8）则随PA剂量增加而升高，PA 为 30mg／mL 和50mg／mL 组 细 胞 内Caspase9水平升高极显著（P＜0．01）。即PA能够激活Caspase9的前体，使其向激活物的方向转变，进而促进细胞进入凋亡程序。

图5 50mg／mL软脂酸组流式细胞检测结果

图6 PA对细胞凋亡率的影响

图7 PA对L02细胞内procaspase9的影响

对Caspase3与的Western blot检测结果显示（图9图10），与未添加PA的对照组相比，随着PA浓度的上升，Caspase3激活物（20kd）的表达逐渐上调（图10）此过程同时伴有Caspase3前体表达量的降低（图9），当PA剂量为30mg／mL时，Caspase3激活物水平上升显著（P＜0．05），当PA剂量为50mg／mL时Caspase3激活物水平上升极显著（P＜0．01）此结果表明PA可激活Caspase3进而诱导细胞进入凋亡阶段。

图8 PA对L02细胞内Caspase9的影响

图9 PA对L02细胞内procaspase3的影响

图10 PA对L02细胞内Caspase3的影响

3 讨论

本研究的形态学检测显示，各PA剂量组内发生凋亡的细胞多处于凋亡早期，细胞发生肿胀，核呈现出波纹状和浓染的亮点；处于凋亡晚期，细胞核形成凋亡小体的细胞数量较少。流式细胞检测结果也与上述结果相吻合，且PA与处于凋亡早期的细胞数量之间呈现正相关的关系。进一步通过 Western blot检测Caspase3与Caspase9后，我们发现PA可以促进激活的Caspase3和Caspase9从二者的前体上裂解下来，诱导细胞进入凋亡的早期阶段。在线粒体信号通路介导的细胞凋亡过程中，随着线粒体膜电位的下降，大量的细胞色素c从线粒体释放进入细胞质，与细胞质中蛋白 Apaf－1结合，使得Caspase－9酶原活化，进而激活下游的效应半胱氨酸蛋白酶Caspase－3［8］，Caspase－3是半胱氨酸蛋白酶酶家族中导致细胞凋亡的最强大的最终效应因子，Caspase－3被激活后，作用于细胞质成分，而使细胞发生凋亡［9］。类似的研究指出，肝癌细胞系HepG2在体外发生脂代谢障碍时可增强其TNF－α的分泌并进一步诱发细胞凋亡［10－11］。TNF－α可通过多个下游信号诱导细胞凋亡，Caspase9和Casepase3也是其中之一，上述内容与本研究的结果相一致。Seidel，N等也曾报道，临床肝脏表现为轻微脂肪变性时以转氨酶为代表的常规生化指标并未表现异常，但血液及肝细胞内Caspase3水平却发生了显著变化［12］。综上所述，Caspase9与Casepase3信号可能在PA诱导L02细胞发生脂凋亡过程中起到重要作用。

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