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子宫内膜息肉及子宫内膜癌组织中雌激素受体β的甲基化与表达研究

2013-09-23花敏慧高薇薇仲建新

中国肿瘤外科杂志 2013年3期
关键词:甲基化息肉免疫组化

姚 微, 黄 华, 花敏慧, 高薇薇, 仲建新

近年来,随着妇科宫腔镜和阴道超声技术的发展,子宫内膜息肉(endometrial polyp,EMP)已成为临床常见妇科疾患。在整个妇女人群中EMP的患病率约为25.0%,其恶变率为1.0% ~1.6%,绝经后妇女的发病率较育龄妇女高,为35.0%,恶变及癌前病变率亦高达10%,即子宫内膜息肉可能是子宫内膜癌的高危因素[1]。EMP的病因学和发病机制至今仍不十分清楚,目前多数学者认为与内分泌紊乱有关。子宫内膜息肉与ER表达、变异及沉默的关系有待进一步研究。研究表明,DNA甲基化与大多数肿瘤的发生相关,抑癌基因启动子CpG岛的高甲基化可引起抑癌基因表达沉默,细胞出现无节制生长,导致肿瘤的发生[2]。本研究通过检测子宫内膜息肉及正常子宫内膜、子宫内膜癌组织中雌激素受体及其甲基化和相关基因的表达,结合临床资料,探讨子宫内膜息肉及子宫内膜癌的发病机理,为其治疗及预防提供理论依据。

1 资料和方法

1.1 标本来源

收集南通大学附属医院2009年6月至2011年1月行子宫切除和诊刮的正常子宫内膜组织标本(40例),在宫腔镜直视下取内膜息肉新鲜组织标本(40例)及因子宫内膜癌手术切除的组织标本(26例)。标本一部分用液氮收集,-70℃低温保存;另一部分标本置福尔马林固定,石蜡包埋,HE染色组织病理学检查。所选病例近3个月均无使用激素史,患者一般情况见表1。子宫内膜癌组织学分型为内膜样腺癌20例,浆液性乳头状腺癌3例,腺鳞癌2例,透明细胞癌1例。

表1 本研究患者的一般情况

1.2 免疫组化法检测ER-β蛋白的表达

1.2.1 主要试剂 免疫组化所用一抗及ELIVISON试剂盒(PV-9000)和DAB酶底物显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2.2 步骤 标本均用甲醛固定,常规石蜡包埋切片。免疫组织化学采用Elivision二步法,柠檬酸盐缓冲液高温高压抗原修复、DAB显色,用阳性备用切片作阳性对照,用PBS代替一抗作阴性对照。

1.2.3 镜下观察 细胞核出现棕黄色或棕色颗粒的细胞为阳性细胞。ER-β阳性物质(棕黄色)位于胞核。每张切片随机选择10个高倍视野,每个视野随机观察100个细胞,计算其中阳性细胞比例。ER阳性细胞比例 <25%为(-),25% ~50%为(+),>50%为(++)。

1.3 DNA提取及亚硫酸氢盐修饰转化

1.3.1 主要试剂 EZ DNA甲基化试剂盒-Direct Catalog No.D5020购自北京天漠科技开发有限公司。

1.3.2 步骤:取低温保存组织标本,室温融化,经蛋白酶K消化,50℃孵育20 min。再直接进行亚硫酸氢盐转化:98 ℃ 8 min,64 ℃ 3.5 h,4 ℃ 18~20 h。DNA经亚硫酸氢盐修饰后,CpG岛中的非甲基化胞嘧啶转变为尿嘧啶,经PCR扩增后转变为胸腺嘧啶;而CpG岛中的甲基化胞嘧啶仍保留。CpG岛以外序列中的胞嘧啶均转变为尿嘧啶,经PCR扩增后均为胸腺嘧啶。洗脱DNA:按照试剂盒上的操作步骤洗脱DNA。

1.4 聚合酶链反应扩增ER-β基因

1.4.1 引物、主要试剂和仪器 ER-β基因启动子序列号为AF191544。各个引物序列见表2。均由上海生物工程公司合成。非甲基化引物U、甲基化引物M分别扩增经修饰后的非甲基化和甲基化启动子区,目标基因片段分别长165 bp和163 bp。PCR试剂盒购自北京天漠科技开发有限公司,型号:Zymo Tap PreMix Cat.Nos.E 2003。PCR 扩增仪为BIO-RAD公司产品C1000,离心机为HITACHI公司产品CT15RE,紫外凝胶分析系统为BIO-RAD公司产品ChemiDocTMXRS+。

1.4.2 PCR反应体系、反应程序及结果观察 25 μL的 反 应 体 系 含 Zymo Tap PreMix12.5 μL、H2O 8.5 μL、上游引物和下游引物各 1 μL、DNA 模板 2 μL。反应条件为预变性95℃ 10 min,35个循环(变性95℃ 1 min,退火54℃ 40 s,72℃ 1 min),72 ℃ 7 min延伸,4℃保存。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,溴化乙啶(EB)染色,紫外凝胶分析系统观察拍照。

表2 ER-β基因启动子甲基化及非甲基化引物

1.5 统计学方法 采用Stata统计软件包进行统计分析。组间阳性率差异的分析采用χ2检验,相关性检验采用定性资料相关分析,以α=0.05为显著性检验标准。

2 结果

2.1 ER-β 蛋白的表达

正常子宫内膜中ER-β的免疫组化结果见图1,阳性率为97.5%(39/40);子宫内膜息肉组织ER-β的免疫组化结果见图2,阳性表达率为70.0%(28/40);子宫内膜癌ER-β的免疫组化结果见图3,阳性表达率为46.2%(12/26)。正常子宫内膜中ER-β表达较子宫内膜息肉中明显增高(χ2=11.11,P<0.01),较子宫内膜癌组织中明显增高(χ2=23.66,P<0.01),子宫内膜癌组织与子宫内膜息肉组织间差异则无统计学意义 (χ2=3.75,P >0.05)。

图1 正常子宫内膜中ER-β表达(×200)

图2 子宫内膜息肉中ER-β表达(×200)

图3 子宫内膜癌中ER-β表达(×200)

2.2 ER-β基因启动子甲基化情况

正常子宫内膜组织、子宫内膜息肉组织及子宫内膜癌组织ER-β基因启动子甲基化情况见图4。子宫内膜息肉组织ER-β基因启动子甲基化率为25.0%(10/40),正常子宫内膜为 10.0%(4/40),子宫内膜癌组织为69.2%(18/26)。正常子宫内膜组织ER-β基因启动子甲基化率较子宫内膜癌组织明显降低(χ2=24.87,P <0.005),较子宫内膜息肉组织差异无统计学意义(χ2=2.62,P >0.05),子宫内膜癌组织与子宫内膜息肉组织差异有统计学意义(χ2=12.62,P <0.005)。

图4 正常子宫内膜,子宫内膜息肉及子宫内膜癌ER-β启动子的甲基化

2.3 ER-β甲基化与表达的相关性

正常子宫内膜组织中ER-β阳性表达与基因启动子甲基化呈负相关 r= -0.54(P<0.005),子宫内膜息肉组织中两者呈负相关 r=-0.37(P<0.05),子宫内膜癌组织中两者呈负相关r=-0.69(P <0.005)。

3 讨论

EMP是子宫内膜基底层的局限性增生,有蒂突向宫腔,由内膜腺体和间质组成。目前,EMP的发病因素和发病机制尚不明确。罗雪梅等[3]经单因素分析显示对EMP发病有统计学意义的因素有孕次、绝经、口服避孕药、近期激素治疗史、慢性子宫内膜炎、宫颈息肉、肥胖、高血压和糖尿病;多因素分析结果认为,绝经、子宫内膜炎和宫颈息肉均为EMP发病的相关危险因素,口服避孕药使发生EMP的危险性降低。

本研究应用免疫组化检测正常子宫内膜、EMP及子宫内膜癌组织中ER-β表达,结果为正常子宫内膜、EMP及子宫内膜癌组织中ER-β表达逐渐下降。解其贵[4]的研究得出ER蛋白在内膜癌组织中的阳性表达率及表达强度明显低于内膜增生组织及正常内膜组织,ER表达下调可能与子宫内膜增生、EMP及癌的发生及预后有关,这一结论与本研究结果一致。

DNA甲基化作为表观遗传学的一种调控机制是最早被人们发现的,其与肿瘤的发生有着密切关系。ER基因的启动子区和外显子1区富含CpG岛,CpG岛的甲基化则会抑制基因转录,导致其失表达。DNA甲基化分析方法很多,但MSP最常用,此方法敏感性高,标本需要量少且要求不高,已被提议作为一种快速和有效的临床工具用于研究恶性肿瘤CpG岛甲基化情况。本研究利用MSP检测正常子宫内膜、EMP及子宫内膜癌组织中ER-β基因启动子甲基化情况,结果为正常子宫内膜及EMP中ER-β基因甲基化率较子宫内膜癌显著降低(均P<0.05)。正常子宫内膜、EMP及子宫内膜癌组织中ER-β的阳性表达与ER-β基因启动子甲基化状态均呈负相关。据此可推测EMP ER-β表达缺失与ER-β基因启动子甲基化相关,ER-β表达缺失可能引起EMP的复发及进一步癌变。

ER-β启动子的甲基化是基因表达沉默的原因之一,也是EMP癌变的早期事件,对于已经发生ER-β甲基化的EMP患者应加以重视,严密随访。

[1] Yildizhan B,Yildizhan R,Ozkesici B,et al.Transvaginal ultrasonography and saline infusion sonohysterography for the detection of intra-uterine lesions in pre-and post-menopausal women with abnormal uterine bleeding[J].J Int Med Res,2008,36(6):1205-1213.

[2] 王中秋,许林.DNA甲基化在非小细胞肺癌诊断和治疗中的应用[J].中国肿瘤外科杂志,2010,2(1):42-46.

[3] 罗雪梅,程秋蓉,孟晓军,等.子宫内膜息肉发病的相关因素研究[J].中国全科医学,2010,13(2C):588-590.

[4] 解其贵.ER、ERβ、PR和PRB在子宫内膜癌组织中的表达及意义[D].青岛:青岛大学,2005.

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