25份普通烟草种质资源遗传多样性的SSR 标记分析

杨 柳，汪 斌，童治军，黄勇兵，曹梅秀，吴海乔，巫升鑫，陈顺辉，兰 涛

(1.福建农林大学作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室，福建福州350002;2.浙江大学农业与生物技术学院，浙江杭州310058;3.福建省烟草科学研究所，福建福州350003)

烟草(Nicotiana tabacum)是我国重要的经济作物，我国烟草种质资源十分丰富.目前已有66个烟属植物种被发现，其中可直接利用的栽培种只有普通烟草(包括烤烟、白肋烟、雪茄烟、香料烟和晒晾烟)和黄花烟草(Nicotiana rusitica L.)［1］.近年来，DNA分子标记在作物种质资源研究、遗传图谱构建、基因定位以及分子标记辅助育种等方面得到广泛应用，常用的分子标记有RAPD、RFLP、AFLP、SSR、ISSR和SRAP等［2－6］.

SSR(simple sequence repeat)标记是一种基于PCR的分子标记，具有共显性遗传、多态性高、信息量大和对DNA质量要求低等诸多优点，在植物遗传多样性研究上已被广泛应用.烟草SSR标记的开发较晚，2007年Bindler et al［7］首次公布了一张烟草微卫星标记遗传图谱，该图谱利用282对SSR引物扩增出293个基因座，分布于24个连锁群上.2011年，Bindler et al［8］又开发了5119对SSR引物，构建了包含2137个SSR标记、2163个基因座的高密度烟草SSR遗传图谱.与其它常用分子标记相比，目前有关烟草SSR标记应用于烟草遗传多样性研究的报道相对较少.徐军等［9］利用8对烟草SSR引物构建了80份烟草种质指纹图谱.刘传胜等［4］利用8对烟草SSR引物对32份代表性烟草种质进行了遗传多样性分析.本研究采用已公布的20对和新开发的82对烟草SSR引物对25份普通烟草种质资源进行遗传多样性分析，以期探讨SSR标记技术在烟草品种亲缘关系的鉴定及遗传多样性研究上的应用，为烟草品种的鉴定、遗传分类、遗传育种等提供依据.

1 材料与方法

1.1 供试材料

25份烟草材料包含烤烟17份、白肋烟2份、香料烟3份、雪茄烟2份和晒晾烟1份，分别来自美国、中国、阿尔巴尼亚、日本等国家，由福建省烟草农业科学研究所提供(表1).

表1 供试烟草的名称、类型及来源Table 1 The names，types and origins of experiment materials

1.2 方法

1.2.1 烟草DNA的提取 分别采集各供试材料的幼嫩烟草叶片(25－28℃下温室培养，光照12 h·d－1)，称取3 －5 g;采用稍加改良的 CTAB 法［10］提取基因组DNA;将DNA 浓度稀释到20 －50 ng·μL－1，4℃保存备用.

1.2.2 SSR分析 采用102对SSR引物对部分供试材料进行扩增和电泳，从中筛选出条带清晰、多态明显的SSR引物.利用选出的SSR引物对25份烟草材料进行SSR分析，102对引物中20对是Bindler et al开发的引物，82对是由浙江大学农业与生物技术学院和福建农林大学合作开发的烟草SSR新引物.

PCR 反应体系(20 μL):2 μL 10 × PCR Buffer，1 μL dNTP(2.5 mmol·L－1)，1.5 U Taq DNA Polymerase，2 μL DNA 模板，上下游引物(5 μmol·L－1)各 1 μL，剩余用 ddH2O 补齐.

PCR反应程序:94℃预变性5 min，94℃变性30 s;57℃(视引物而定)退火30 s;72℃延伸30 s(39个循环);最后72℃延伸10 min.

PCR扩增产物用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和快速银染法［10］分析，稳定电压220 V，电泳2 h左右.

1.3 数据处理

选择清晰可辨的电泳主条带进行统计分析，按扩增条带的有无记数，在相同迁移率位置上，有带记为“1”，无带记为“0”.引物的鉴别能力用多态信息量(PIC)表示，PIC=1－其中n为该位点的等位基因数，Pi为第i个等位基因在群体中的频率，Pj为第j个等位基因在群体中的频率，PIC值由PIC_CALC Version 0.6软件计算得出.

应用NTSYSpc 2.10e分析软件，按文献［11］的方法统计任意2份种质的遗传相似系数 GS=2Nij/( Ni+Nj)，其中Nij为i、j 2份种质共有的等位基因数，Ni和Nj分别代表i、j种质的等位基因数.遗传距离GD=1－GS，然后采用非加权组平均法进行聚类分析.

2 结果与分析

2.1 SSR 标记

2.1.1 SSR引物鉴别能力 对102个SSR标记进行筛选，发现14对引物能扩增出稳定清晰的多态性条带(表2).利用这14对引物对25份烟草种质进行PCR扩增及电泳分析，其中引物PT20213的扩增结果见图1.

表2 14对SSR引物名称、序列及退火温度Table 2 The names，sequences and annealing temperatures of 14 pairs of SSR primers

图1 引物PT20213对25份烟草基因组DNA的扩增结果Fig.1 Result of DNA amplification of 25 tobacco DNA using primer PT20213

在14个SSR位点上，共检测到97个等位基因片段，每个位点上有4－10个等位基因，平均每对引物可检测到的等位片段数为6.9个.引物的PIC值为0.53－0.815，平均值为0.694，说明这些引物总体上具有很好的鉴别能力.其中引物TM11227的PIC值最高，为0.815.这种高鉴别力的引物只需较少的用量就能将所有供试材料区分开来(表3).

2.1.2 特异SSR标记 某些引物可在一些材料中扩增出特异条带，从而用1对这样的SSR引物就能将某些种质单独区分出来.14对SSR引物中除TM10180外，均可在特字401、长勃黄、闽烟7号、B07-8、花溪大青杆、Burley21、Basma Llovina、新昌香料烟、Xanthi NO-1、铁杆青、督叶尖干种和打洛晒烟12份烟草种质中扩增出特异性条带，从而能特异性地区分其中之一或同时区分几份烟草种质.如引物TM10089可将花溪大青杆、Basma Llovina、Xanthi NO-1、铁杆青和督叶尖干种5个材料单独区分开.而某些烟草种质的特异引物不止 1条，如 Basma Llovina有 6条特异引物(PT21213、PT20372、TM10089、TM10811、TM11166和TM11097);铁杆青有5条特异引物(PT20213、TM10089、TME0082、TPM10899和TM11215).其中3种香料烟有4－6条特异引物，2种雪茄烟分别有3条和5条特异引物，而只有少数烤烟仅有1－2条特异引物，表明普通烟草中烤烟品种内的遗传差异相对较小.

2.2 遗传相似性与差异性

利用这14对SSR引物对25个烟草种质基因组进行PCR电泳检测后得到〔0，1〕矩阵，先计算出不同种质间的GS，得到25份烟草种质间的GS为0.701－0.959，平均值为0.787.其中Coker176与花溪大青杆、Basma Llovina、Xanthi No.1、督叶尖干种的 GS最小，表明其遗传差异较大;而 Coker347与 K358、G80，G80与岩烟97的GS最大，表明其遗传差异最小.通过分析普通烟草种类内的遗传多样性水平，发现17份烤烟平均GS达到0.821，整体遗传差异较小;2种白肋烟的GS高达0.918，遗传差异也很小，3种香料烟之间的平均GS相对较小(0.718)，表明其遗传差异较大.烤烟类型与白肋烟、香料烟、雪茄烟、晒烟类型间的平均GS为0.736－0.760，表明其具有一定的遗传多样性.

表3 14对烟草SSR引物的扩增结果Table 3 Amplification results of 14 pairs of tobacco SSR primers

2.3 烟草种质的聚类分析

为了确定25份烟草种质在基因组上的遗传关系，利用SSR的GS矩阵按UPGMA方法进行聚类，构建了各个供试烟草材料的亲缘关系(图2).

图2 25份烟草材料的SSR聚类图Fig.2 Cluster dendrogram of 25 tobacco germplasms based on SSR markers

在GS为0.766(L1)处，可以将25份烟草材料分为五大类:第1大类包括15份烤烟种质(1－8和11－16);第2大类包括2种白肋烟(18、19号)和1种烤烟(9号);第3大类包括20号香料烟Basma Llovina和25号打洛晒烟;第4大类包括2种香料烟(21和22号)和2种烤烟(10、17号);第5大类包括雪茄烟23、24号.其中长勃黄、红花大金元和花溪大青杆与其它烤烟的差异比较明显.上述分类与普通烟草按品种特性、调制类型的分类(烤烟、晾晒烟、白肋烟、香料烟和雪茄烟)不完全相同，说明两者之间没有必然联系.

在L2=0.85分割线处，第3、4、5大类中的材料均各自单独聚为一类;而第2大类中2种白肋烟与烤烟长脖黄区分开.此时GS比较高的第1大类烤烟被分为3类:源自美国的特字401单独聚为第1小类;第2小类包括11个烤烟种质，其中7个来源于美国，其余4个均由国外一些优良品种培育而来;第3小类为福建省的2个烤烟翠碧一号(15)和B07-8(16号).将这11份烤烟再细分(L3=0.895):其中K346、K358、G80、岩烟97(G80的衍生种)、Coker 347、Coker 176、系3归为一类;来自美国的烤烟D101和SPG-117归为一类;国内的烤烟云烟85和闽烟7号(云烟85×Coker347)归为一类.其中福建的5个烤烟品种(翠碧一号、B07-8、系3、岩烟97和闽烟7号)并未按地域归为一类，而是与其各自的亲本聚在一起.这种聚类与烟草种质的育成亲本来源有关，但与其地域来源没有必然联系.

3 讨论

Coussirat［12］最早将RAPD技术用于烟草遗传差异性的研究，采用160个RAPD随机引物分析32份烟草种质的遗传差异，其中9个引物扩增出29条多态性条带，占引物总数的5.63%.王志德等［13］采用43个RAPD引物对24份烟草核心种质进行了分析，共扩增出214个条带，平均每个引物扩增条带数为4.98.可见将RAPD技术应用于烟草种质遗传多样性分析的效率较低.

Moon et al［14］利用46对SSR引物对54份烟草属材料进行了聚类分析，得到的结果与传统的基于形态学、细胞学及分子学的观察分类结果一致.叶兰钦等［15］运用Bindler发表的92个SSR标记分析13个云南省烟草主栽品种的遗传多样性，在有多态的20个SSR基因座上共检测到52个等位片段，平均每对引物检出等位片段数为2.6个，引物多态性约22%.徐军等［9］利用Bindler发表的286对SSR引物中多态性较好的8对引物，构建了80份普通烟草种质的指纹图谱，检测到的多态性位点85个，平均PIC值为0.81.本研究从Bindler发表的20对和82对待发表的SSR引物中筛选出14对多态性引物(占14%)，共检测到97个等位片段，平均每对引物等位片段数为6.9个，平均PIC值达到0.694.这些引物能在某些烟草种质中扩增出特异带的标记，可作为单独区分这些种质的候选标记.说明SSR标记可有效用于烟草种质遗传多样性研究.

本试验采用SSR标记对25份普通烟草种质的扩增结果表明，GS为0.701－0.959，GS平均值为0.787，17份烤烟种内平均GS达到0.821，表明其遗传相似性较高，这与以往大部分的研究结果一致［16－18］.聚类分析结果表明普通烟草种质间的遗传差异与其品种特性、调制类型、地理来源的差异没有必然联系，这与梁景霞等［19］、王志德等［13］、肖炳光等［20］的研究结果相符.普通烟草种质间的品种特征、调制类型的差异，大多是在特定生态环境和长期人工选择中逐渐形成的，但种质间的遗传差异与其血缘密切相关.国内培育的一些烤烟种质与各自的亲本聚在一起，体现了一定的品系形成规律.如由云烟85×Coker347杂交选育而来的闽烟7号与其亲本之一云烟85聚在一起，表明其遗传相似性很高.

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