冬虫夏草虫草素的提取及提取量的测定

刘 栓 栓, 孙 庆 元, 宫 宏 琨

(大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连 116034)

0 引 言

冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌(Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.)寄生在蝙蝠蛾科昆虫蝙蝠蛾(Hepialus armoricanus Oberthur)越冬幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体。虫草素(cordycepin)是冬虫夏草菌中的活性成分。虫草素的结构与腺苷非常相似,所以又称为3′-脱氧腺苷,也是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗菌素[1-2],具有抗肿瘤[3]、抗菌抗病毒[4]、免疫调节、清除自由基[5]等多种药理作用。最早由Cunningham[6]等于1951年在Cordycepsmilitaris Link原浆液中分离获得,该物质被证实为我国中药冬虫夏草的有效成分,是虫草特有的功能成分。

目前从蛹虫草中提取和纯化虫草素比较常见。对于虫草素的提取一般采用微波提取[7]、超声波提取[8]、回流[9]、索氏提取[10]、浸提等方法。虫草素的检测的方法也很多,例如高效液相色谱[11]、毛细管电泳[12]、紫外[13]等方法。然而,方法简单、操作较易、成本低廉的虫草素提取和测定方法报道不多,特别是关于超声波细胞破碎提取方法条件的研究较少。因此,本试验采用超声波细胞破碎法进行提取,进行了虫草素提取条件的分析和优化,并通过紫外分光光度法分析测定虫草素的含量。

1 试验材料

1.1 原 料

无性型虫草qsun-1菌株[14],采集自四川省阿坝藏族羌族自治州黑水县,经分离纯化后冰箱4 ℃保存。

1.2 试 剂

虫草素(高纯试剂),中国药品生物制品鉴定所；甲醇、无水乙醇,山东禹王实业有限公司化工分公司；717强碱性阴离子交换树脂,国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.3 培养基

1%牛肉粉PDA培养基(g/L):马铃薯200(煮沸30 min,过滤取汁),葡萄糖20,牛肉粉10,维生素B10.1,KH2PO41,MgSO41,琼脂 20,pH 6.0,用于菌种的活化。

液体发酵培养基(g/L):葡萄糖20,牛肉粉10,维生素B10.1,KH2PO41,MgSO41,琼脂 20,pH 6.0,用于菌种的发酵。

2 方 法

2.1 培养方法

菌种活化:将接种后的PDA平板培养基18 ℃ 培养7 d。

种子液:虫草菌株qsun-1接种在1%牛肉粉PDA液体培养基中,于18 ℃、120 r/min振荡培养3 d。

菌种发酵培养:在250 mL三角瓶中装入100 mL 发酵培养基,并将培养好的种子液按5%的接种量接种到发酵培养基中,于18 ℃、120 r/min振荡培养5～7 d。

2.2 虫草菌株样品制备

取出在摇床培养好的虫草qsun-1菌株发酵液。3 000 r/min离心10 min。弃去上清液,将剩下的固体虫草菌丝体充分洗涤、抽滤,置于60 ℃烘箱烘干、粉碎,称干重。

2.3 虫草素提取的条件优化

2.3.1 超声波冰浴条件准备

在250 mL烧杯中装入2/3的冰块,在冰块中挖出可放进50 mL烧杯的空间,然后盖上泡沫环,放入小烧杯[15]。

2.3.2 单因素试验

精确称取0.145 0 g虫草菌丝体,于超声波细胞粉碎机中按提取基本条件(400 W、5 s、5 s)破碎提取20 min,分别考察提取溶剂、超声波功率、超声波提取时间、料液比对虫草素提取的影响。

其中要考察的试验条件具体为提取溶剂:蒸馏水、甲醇、无水乙醇；超声波功率:100、200、300、400、500、600 W；超声波提取时间:10、15、20、25、30、35 min；料液比(g/mL):1∶100、1∶130、1∶160、1∶190、1∶220、1∶250。

2.3.3 正交试验

在单因素试验基础上,通过正交试验进一步考察提取溶剂、超声波功率、提取时间和料液比之间的相互影响,并确定超声波细胞破碎提取冬虫夏草菌丝体中虫草素的最佳工艺参数。

2.4 分析检测方法

2.4.1 紫外分光光度法检测虫草素含量

精密称取5 mg虫草素标准品,分别配制0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L的虫草素溶液,紫外分光光度法测量吸光度,并以吸光度(Y)对虫草素的质量浓度(X)进行线性回归,得虫草素的回归方程为:Y=0.061 23X+0.013 1,R=0.997 9。

2.4.2 虫草素提取量的计算

虫草素提取量=虫草素质量浓度×稀释体积/冬虫夏草菌丝体质量。

2.5 样品纯化

将超声波细胞破碎提取法最佳工艺提取的样液,分别量取1、2、3 mL各3份,同样条件下9份样液分别经717强碱性阴离子树脂纯化,紫外分光光度法检测虫草素提取量,计算虫草素纯化洗脱得率和纯度。

3 结果与分析

3.1 冬虫夏草虫草素的定性检测

将提取样在紫外分光光度计100～500 nm波长范围内扫描,结果如图1所示。

图1 虫草素紫外光谱扫描曲线

由图1可知,样品在259 nm处有最大吸收峰,虫草素吸收光谱在259 nm[16],可判定样品中含有虫草素。

3.2 虫草素提取条件的确定优化

3.2.1 提取溶剂对虫草素提取量的影响

以蒸馏水、甲醇和无水乙醇作为提取溶剂进行提取虫草素,结果如图2所示。

图2 不同提取溶剂对虫草素提取量的影响

由图2可以看出,以甲醇作溶剂提取虫草素的效果最佳,分别比以蒸馏水和无水乙醇作溶剂时虫草素提取率高8.15%和29.18%。蒸馏水作溶剂也比无水乙醇作溶剂提取虫草素的效果好。因此,选择甲醇作为提取溶剂。

3.2.2 超声波功率对虫草素提取量的影响

采用甲醇为提取溶剂,超声波提取时间为20 min,结果如图3所示。在超声波功率较小时,随着超声波功率的增加,虫草素提取量也不断增加,在超声波功率达到400 W之后,虫草素提取量开始减少,超声波功率到达600 W时,虫草素提取量比功率100 W时的还少。

图3 超声波功率对虫草素提取量的影响

原因可能是在超声波功率适当时,超声波可在液体中产生“空穴作用”,而“空穴作用”产生的冲击波和射流可以破坏细胞和细胞膜结构,从而增加细胞内容物通过细胞的穿透能力,有助于虫草素的释放和溶出,超声波使提取液不断振荡,有助于溶质扩散[17]。当超声波功率过大时,产热更快,导致分子的裂解,使部分虫草素有所损失。凌建亚等[12]也认为物质的加热程度和细胞的破碎程度与超声波的功率有关。因此,选择功率为400 W的超声波。

3.2.3 提取时间对虫草素提取量的影响

采用甲醇为提取溶剂,超声波功率400 W,考察了不同的超声波提取时间对虫草素提取的影响,结果如图4所示。随着超声波提取时间的增加,虫草素提取量也增加,当达到20 min时,虫草素提取量达到最高,每克菌丝体可提取8.459 mg虫草素。然后,随着超声波提取时间继续增加,虫草素提取量却不断下降。

图4 超声波提取时间对虫草素提取量的影响

原因可能是在超声波提取时间适当时,超声波的热效应使水温对原料有水浴作用[17],但随着提取时间的持续增加,热量积累越来越多,破坏了部分虫草素。因此,选择超声波提取时间为20 min。

3.2.4 料液比对虫草素提取量的影响

在以甲醇作为提取溶剂、超声波功率400 W、提取时间20 min的条件下,分别采用不同的料液比对虫草素进行提取,结果如图5所示。由图5可以看出,随着料液比的增加,虫草素提取量也增加,当料液比达到1∶130时,虫草素的提取量达到最大,每克菌丝体可提取8.568 mg虫草素。当料液比超过1∶130时,随着料液比的增加,虫草素的提取量逐渐减少,当料液比增加到1∶220,虫草素的提取量有所增加,但是仍低于1∶130 时虫草素的提取量,然后随着料液比的继续增加虫草素提取量呈减少的趋势。因此,选择料液比为1∶130。

图5 料液比对菌丝体中虫草素提取量的影响

3.2.5 超声波细胞破碎提取虫草素不同条件的正交分析

根据单因素试验结果,选择不同的提取溶剂(A)、超声波功率(B)、提取时间(C)和料液比(D)为影响因素,选用L9(34)正交表进行试验,正交试验因素水平表见表1,试验结果见表2。

表1 正交试验因素水平表

表2 超声波细胞破碎提取工艺L9(34)正交试验结果分析

Tab.2 Analysis of the L9(34) orthogonal experiments for extraction process of ultrasonic cell disruption

试验组 A B C D虫草素提取量/(mg∙g-1)111118.568212226.456313337.874421235.238522329.112623117.841731327.186832234.818933117.370Ⅰj22.89820.99221.22725.050t=64.463Ⅱj22.19120.38619.06421.483Ⅲj19.37423.08524.17217.930极差R j3.5242.6995.1087.120主次顺序D>C>A>B最优方案A1-B3-C3-D1

如表2所示,各因素对虫草素提取量的影响次序是D>C>A>B,即料液比最为重要,其次为提取虫草素的溶剂,再次为超声波功率,最后是提取时间。其最优方案为A1-B3-C3-D1,即最优提取工艺是冬虫夏草菌丝体在料液比为1∶100、提取溶剂为甲醇、超声波功率为300 W的条件下进行细胞破碎,并提取30 min时可提取的虫草素量最大。

3.2.6 最佳工艺条件的验证

由于最佳组合A1-B3-C3-D1不在正交试验设计中,且正交试验设计范围没出现峰值,应扩大试验范围进一步设计试验。按照正交试验优选工艺A1-B3-C3-D1和试验设计中的较优组合A2-B2-C3-D2,进行验证对比试验,结果见表3。

表3 超声波细胞破碎提取优选工艺验证

由表3可以看出,正交试验优选工艺A1-B3-C3-D1的虫草素提取量为9.275 mg/g,而A2-B2-C3-D2工艺的虫草素提取量为9.112 mg/g。通过差异显著性分析,两种提取工艺在α=0.05水平下有显著性差异。因此,可以确定最优工艺为A1-B3-C3-D1,即提取料液比为1∶100、溶剂为甲醇、超声波功率为300 W、提取时间为30 min,虫草素提取量最大。

3.3 离子交换法纯化虫草素

用717强碱性阴离子交换树脂纯化冬虫夏草菌丝体中的虫草素提取液,用蒸馏水作为洗脱试剂,结果如表4所示。

表4 717强碱性阴离子交换树脂纯化提取液样品洗脱得率和纯度

Tab.4 Elution rate and purity for extract sample using 717 strong-based anion exchange resin

纯化前样品提取量/μg纯化后样品提取量/μg保留率/%纯度/(mg∙L-1)17.37614.20081.7214.20034.75227.96780.4713.98452.12841.72980.0513.910

由表4可以看出,虫草素的洗脱率为80.05%～81.44%,平均值为80.75%,虫草素的质量浓度为13.910～14.200 mg/L,平均值为14.031 mg/L。纯化后的样品紫外全波段扫描图杂质峰减少,虫草素的保留率也较高。因此,用717强碱性阴离子交换树脂纯化虫草素提取液是一种可靠有效的纯化手段。

4 结 论

通过单因素试验和正交试验得出超声波细胞破碎提取虫草素的最佳工艺条件:提取溶剂为甲醇、超声波功率为300 W、超声波全程作用时间为30 min、料液比(g/mL)为1∶100。超声波细胞破碎提取方法在中药有效成分提取、分离和制备工艺中的应用,可以大大缩短提取时间,且低温提取有利于保护有效成分,是一种操作简便,受外界干扰因素限制少的虫草素提取方法。通过717强碱性阴离子交换树脂纯化虫草素提取液,紫外全波段扫描图杂质峰减少,虫草素保留率比较高,是一种可靠有效的虫草素纯化方法。

测定无性型冬虫夏草qsun-1子实体中虫草素的含量较高,表明该冬虫夏草菌株的品质优良,具有较好的开发利用价值。

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