羊肚菌液体发酵培养基成分及培养条件的优化

2013-09-22张光宇杜秀娟杨玉红

中国酿造 2013年10期

杨建，张光宇，杜秀娟，杨玉红*

（沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁沈阳 110161）

羊肚菌属于子囊菌亚门，是世界著名的野生食（药）用菌，肉质脆嫩鲜美且药用价值高，也是一种高级营养滋补品。因其表面有蜂窝状的可孕头部，外观极似羊肚而得名[1-2]。羊肚菌富含蛋白质、氨基酸、多糖、维生素、多种矿物质及丰富的脂肪酸等，具有增强肌体免疫力、促进副肾皮激素的分泌、降低胆固醇、预防动脉硬化、抗疲劳、抗病毒、抑制肌癌-180等诸多作用，是一味良好的传统中药[3-8]。但是羊肚菌人工栽培存在着既要促使子实体原基形成，又要激发双核化菌丝体形成的双重困难，栽培难度很大[9]，所以至今仍不能进行羊肚菌子实体的大规模工业化生产。然而，研究发现，羊肚菌的菌丝体所含成分以及所具有的功效都与子实体相似，而且还能较好的保持子实体独特的风味，适合液体培养[10]。液体发酵法生产食用菌的菌丝体要比栽培子实体简便快速，许多目前还不能进行人工栽培的野生食用菌（如羊肚菌、牛肝菌、松菇、块菌、鸡油菌等）都可以用液体发酵法来生产菌丝体[11]。这样一来，菌丝体发酵技术便成为解决资源问题的最佳途径，给羊肚菌的产业化生产开辟了一条新路，而且液体发酵可以进行工业化的连续生产，具有规模大、菌丝体产量高、发酵周期短、生产效益高等优点[12]，所以液体菌丝体的发酵已成为当前研究的热点，在食品、医药、保健、化妆品等领域显示出极大的开发潜力[13-15]。

研究通过单因素和正交试验，确定羊肚菌的最优液体培养基配方和最佳发酵工艺条件，对系统开发菌类产品、提高菌类产品的价值具有重要意义[16]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

沈阳农业大学生物工程实验室保存。

斜面培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨0.5g，牛肉膏0.5g，琼脂20g，pH值自然，水1000mL。

种子液培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨0.5g，牛肉膏0.5g，pH值自然，水1000mL。

发酵培养基：葡萄糖25g，酵母膏25g，MgSO41g，KH2PO42g，VB12g，pH 6，水1000mL。

1.2 仪器与设备

LDZX-40BI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器：上海中安医疗器械厂；SW-CJ-ICU双人单面净化工作台：浙江苏净净化设备有限公司；HPX-9082 MBE数显电热培养箱：上海沪粤明科学仪器有限公司；BS-2F振荡培养箱：常州迈科诺仪器有限公司；LXJ-68-02型离心机：上海医分仪器制造有限公司；DZF-6090型真空干燥箱：上海双旭电子有限公司。

1.3 试验方法[17-25]

将马铃薯洗净去皮后，切成小块煮沸约30min，煮至熟而不烂为止，四层纱布过滤，再配以其他成分，加水定容，混合均匀，分装在试管中，每只试管约10mL，在121℃灭菌30min，摆斜面放凉备用。将所有与接种有关的器具在超净工作台中通过紫外线杀菌30min后，在无菌环境下用接种环挑取于4℃保藏的羊肚菌菌种，转接到新鲜的斜面培养基上，在28℃恒温培养箱中培养5d～7d。

1.3.2 液体种子培养液的制备

按照种子液培养基配方制作培养基，分装在250mL三角瓶中，灭菌。在无菌条件下，用接种环从斜面培养基上挑取羊肚菌菌丝体，接入装有液体种子培养基的三角瓶中，置28℃恒温摇床振荡培养，转速130r/min，培养5d得一级种子培养液。

1.3.3 液体发酵培养液的制备

准确称取葡萄糖25g，酵母膏25g，MgSO41g，KH2PO42g，VB12g放入1000mL的烧杯中，加入500mL蒸馏水，加热使其全部溶解，加水定容至1000mL，混合均匀，用量筒量取90mL发酵液倒入250mL三角瓶中灭菌。放凉后，放入超净工作台上并将所有与接种有关的器具通过紫外线杀菌30min。在无菌条件下，从种子培养液中吸取10mL的种子液加入发酵培养基中，置28℃恒温摇床振荡培养，转速130r/min，培养7d。

1.3.4 发酵培养基成分及培养条件的单因素试验

会上，国内外专家、果农示范户等就苹果新品种推广及产业发展、以色列农业水肥一体化应用、白水苹果种植及水肥一体化应用等内容进行了分享，诺贝丰推出的以“深海能”系列水溶肥产品为依托的苹果种植全程营养解决方案更是受到了与会果农的广泛关注和欢迎。同时，会上还举办了白水县商务局、农机局为农村电商托管团队、机械化作业服务团队的授旗仪式，这标志着白水苹果产业又实现了进一步深化发展。

（1）碳源筛选试验：将液体发酵培养基中的碳源葡萄糖分别用等量（25g/L）可溶性淀粉、蔗糖、果糖、麦芽糖替换，培养条件与发酵培养基培养条件相同，考察不同碳源对羊肚菌菌丝体生物量的影响。

（2）氮源筛选试验：将液体发酵培养基中的氮源酵母膏分别用等量（25g/L）蛋白胨、牛肉膏、硫酸铵、硝酸钾替换，培养条件与发酵培养基培养条件相同，考察不同氮源对羊肚菌菌丝体生物量的影响。

（3）pH值筛选试验：将液体发酵培养条件中的pH值分别调至4、5、6、7、8，培养基成分和其他培养条件与发酵培养基成分和培养条件相同，考察不同pH值对羊肚菌菌丝体生物量的影响。

（4）温度筛选试验：将液体发酵培养条件中的发酵温度分别调至22℃、24℃、26℃、28℃、30℃，培养基成分和其他培养条件与发酵培养基成分和培养条件相同，考察不同发酵温度对羊肚菌菌丝体生物量的影响。

（5）摇床转速筛选试验：将液体发酵培养条件中的摇床转速分别调至110r/min、120r/min、130r/min、140r/min、150r/min，培养基成分和其他培养条件与发酵培养基成分和培养条件相同，考察不同转速对羊肚菌菌丝体生物量的影响。

1.3.5 发酵培养基成分及培养条件优化的正交试验设计

通过单因素试验，每组选取3个水平作正交优化试验设计。通过SPSS软件的方差分析和比较，选取发酵培养基及培养条件的最适发酵配方和发酵条件。

1.3.6 测定方法及计算公式

取发酵液5000r/min离心10min，弃上清液，所得菌丝体用蒸馏水洗再离心，反复洗涤离心2～3次后，置于40℃干燥箱中烘干，并称质量，计算出每200mL发酵液中的菌丝体生物量（g/200mL）。

2 结果与分析

2.1 发酵培养基成分及培养条件单因素试验

2.1.1 最适碳源的筛选

图1 不同碳源对羊肚菌菌丝产量的影响Fig.1 Effect of carbon sources on yield ofMorchellamycelium

由图1可知，羊肚菌菌丝在碳源为葡萄糖、可溶性淀粉、麦芽糖、果糖、蔗糖的发酵培养基中均能较好生长，但也存在着明显差异，菌丝产量顺序为蔗糖＞葡萄糖＞可溶性淀粉＞麦芽糖＞果糖，所以碳源选取蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉作正交试验。

2.1.2 最适氮源的筛选

由图2可知，羊肚菌菌丝在氮源为蛋白胨、牛肉膏、硫酸铵、硝酸钾酵母膏的发酵培养基中均能较好生长，但也存在着明显差异，菌丝产量顺序为牛肉膏＞酵母膏＞蛋白胨＞硝酸钾＞硫酸铵，所以氮源选取蛋白胨、牛肉膏、酵母膏作正交试验。

2.1.3 最适pH值的筛选

由图3可知，羊肚菌菌丝在pH值为4的时候，菌丝不生长，而羊肚菌菌丝在pH值为5、6、7、8时均能生长，但也存在着明显差异，菌丝产量顺序为pH 6＞pH 7＞pH 8＞pH 5，所以pH值选取6、7、8作正交试验。

图2 不同氮源对羊肚菌菌丝产量的影响Fig.2 Effect of nitrogen sources on yield ofMorchellamycelium

图3 不同pH值对羊肚菌菌丝产量的影响Fig.3 Effect of pH value on yield ofMorchellamycelium

2.1.4 最适温度筛选

图4 不同发酵温度对羊肚菌菌丝产量的影响Fig.4 Effect of fermentation temperature on yield ofMorchella mycelium

由图4可知，羊肚菌菌丝在温度为22℃、24℃、26℃、28℃、30℃的发酵条件下均能较好生长，但也存在着明显差异，菌丝产量顺序为28℃＞26℃＞24℃＞30℃＞22℃，所以发酵条件温度选取24℃、26℃、28℃作正交试验。

2.1.5 最适转速筛选

由图5可知，羊肚菌菌丝在摇床转速分别为110r/min、120r/min、130r/min、140r/min、150r/min的条件下均能较好生长，但也存在着明显差异，菌丝产量顺序为140r/min＞130r/min＞120r/min＞150r/min＞110r/min，所以发酵条件摇床转速选取120r/min、130r/min、140r/min作正交试验。

图5 不同摇床转数对羊肚菌菌丝产量的影响Fig.5 Effect of rotation shaker on yield ofMorchellamycelium

2.2 羊肚菌发酵培养基成分及培养条件优化的正交试验

表1 发酵培养基成分及培养条件正交优化试验设计Table 1 Design of orthogonal test for fermentation medium composition and optimization of cultivation conditions

表2 发酵培养基成分及培养条件正交试验结果Table 2 Results of orthogonal test for fermentation medium composition and cultivation conditions

表3 发酵培养基成分及培养条件正交试验方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test result for fermentation medium composition and cultivation conditions

根据单因素试验的结果，碳源选取蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉，氮源选取蛋白胨、牛肉膏、酵母膏，再添加MgSO4、KH2PO4、VB1，发酵条件pH值选取6、7、8，温度选取24℃、26℃、28℃，摇床转速选取120r/min、130r/min、140r/min，进行3个水平5个因素的正交试验设计（见表1），正交试验的结果见表2，方差分析结果见表3。由表2和表3可知，不同组合之间菌丝生物量是不同的，各因素间的极差次序为氮源＞摇床转速＞发酵温度＞pH值＞碳源，极差越大，起的作用就越大，这说明氮源对生物量影响最大，摇床转速次之，从菌丝体生物量来考察各因素水平值，A可取A2，B取B3，C取C2，D取D3，E取E3，因此选定最适合羊肚菌液体发酵培养基组合为A2B3C2D3E3，即可溶性淀粉2.5%，酵母膏2.5%，MgSO40.1%，KH2PO40.2%，VB10.2%；最适培养条件pH值为7，发酵温度为28℃、摇床转速为140r/min，在最佳条件下所生产的菌丝生物量为3.438g/200mL。

3 结论

根据液体培养基的原则和方法，采用单因素试验，优选出适合羊肚菌液体培养的碳源、氮源，发酵条件pH值、发酵温度、摇床转速。由羊肚菌液体发酵培养基及发酵条件的正交试验可知，最适的发酵培养基成分和培养条件为：可溶性淀粉2.5%，酵母膏2.5%，MgSO40.1%，KH2PO40.2%，VB10.2%；最适培养条件pH值为7，温度为28℃、摇床频率140r/min，培养7d，在最佳条件下所生产的菌丝生物量为3.438g/200mL。羊肚菌摇瓶液体发酵培养参数为今后开展发酵罐试验，探索羊肚菌菌丝体规模化生产的工艺条件奠定了基础。

[1]马向东，陈红歌.食用菌栽培新技术[M].开封：河南大学出版社，2002.

[2]陈向东，朱戎，兰进.羊肚菌的研究进展[J].食用菌学报，2002，9（2）：56-61.

[3]张广伦，张卫明，李玉.羊肚菌的研究与利用[J].中国野生植物资源，1999，18（1）：1-3.

[4]宋淑敏，邹作华，王洪荫，等.EF-11营养液的研制及其保健作用的试验研究[J].食品科学，1996，17（7）：52-57.

[5]CAVAZZONI V,ADAMI A,ARAGOZZINI F,et al.Meddpharm scientific[J].Publishers,1994(2):119-127.

[6]欧阳天贽，李小定，荣建华.真菌多糖抗肿瘤及免疫调节作用研究进展[J].天然产物研究与开发，2000，18（3）：524-528.

[7]赵桂云，马庆斌.羊肚菌液体培养基配方的研究[J].食用菌，2002（6）：15-16.

[8]张松，夏艳红，姚珍平.羊肚菌菌丝生物学特性研究[J].食用菌学报，2002，9（1）：18-21.

[9]朱斗锡.羊肚菌工厂化栽培技术的探讨[J].浙江食用菌，2010，18（1）：43-44.

[10]赵桂云，马庆斌.羊肚菌液体培养基配方的研究[J].食用菌，2002（6）：15-16.

[11]朱玉昌，周大寨，唐巧玉，等.富硒野生食用菌液体培养条件初步优化[J].中国酿造，2009，28（4）：61-64.

[12]王莹，孙永海，王笑丹，等.粗柄羊肚菌菌丝液体培养条件的优化[J].食用菌，2007，29（6）：5-8.