川藏高原威代尔冰葡萄中酵母菌的分离、筛选及其耐受性研究

张丽珠，邢亚阁，许青莲，卢 靖，车振明*，罗建峰

（1.西华大学 生物工程学院食品生物技术重点实验室，四川 成都 610039；2.理县塔斯酒庄有限公司，四川 阿坝藏族羌族自治州 623104）

冰葡萄酒是利用在-7℃以下，在葡萄树上自然冷冻和风干的葡萄酿造的葡萄酒。冰葡萄果实中的糖分及其他内容物得到高度浓缩[1-2]，可获得高品质的葡萄原料酿造出品质优异的葡萄酒。葡萄酒的酿造是通过酵母菌的作用，将葡萄原料中糖转化为酒精[3]。优良葡萄酒酵母应具有生长速率快、耐高糖、耐SO2、发酵平稳、酒精产率高、发酵完全等特性[4]。目前，我国葡萄酒的生产主要是自然发酵或者引进国外活性干酵母接种发酵，自然发酵最大可能的保留了产地葡萄的品质和特色，但是存在发酵过程不易受控制、发酵周期长且酒品质量不稳定等缺点；而大量引进国外活性干酵母接种发酵，造成了国内葡萄酒口味的趋同化[5]，制约了具有中国地域特色葡萄酒的生产。从产地葡萄中筛选出适合本地区葡萄酒发酵的酵母菌，不仅可以解决自然发酵中存在的问题，还能酿造具有地区特色的优质葡萄酒。

从种植于四川阿坝的威代尔冰葡萄中分离出酵母菌，将其纯化后，初筛出产气能力和产醇能力优异的酵母，并研究其耐受性试验，旨在筛选出适合四川阿坝地区特色冰葡萄酒发酵的优良酵母菌。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

威代尔冰葡萄：塔斯酒庄提供；酒石酸、亚硫酸氢钠、氢氧化钠、葡萄糖、氯化三苯四氮唑（triphenyl tetrazolium chloride，TTC）、乙醇、甘油：成都科龙化工试剂厂；酵母粉、蛋白胨、琼脂粉、孟加拉红培养基、麦芽汁培养基等：北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.1.2 培养基

孟加拉红培养基：市售成品，按说明比例加水，121℃灭菌2min。

麦芽汁培养基：市售成品，按说明比例加水，115℃灭菌15min。

酵母膏胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）YPD培养基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉1g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min，固体培养基添加15g琼脂粉。

TTC上层培养基[6]：葡萄糖5g，TTC 0.5g，琼脂粉15g，水1000mL，pH 6.0，加热溶解。

WL培养基[7]：酵母浸粉4g，胰蛋白胨5g，葡萄糖50g，磷酸二氢钾0.55g，氯化钾0.425g，氯化钙0.125g，硫酸镁0.125g，氯化镁0.0025g，硫酸锰0.0025g，琼脂15g，溴甲酚绿0.022g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。

1.1.3 仪器与设备

DHP-9052型电热恒温培养箱：上海益恒实验仪器公司；pHS-25精密pH计：上海精科雷磁仪器厂；721分光光度计：上海精密科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌的分离、纯化

稀释涂布分离：威代尔冰葡萄压榨后清液备用，在无菌操作下将压榨后的清液稀释成10-2、l0-3、l0-4倍的稀释液，取0.1mL涂布于孟加拉红平板，置于30℃恒温培养箱中培养48h。

划线纯化：选取菌落均匀的平板，无菌操作下挑取单菌落于孟加拉红培养基上划线纯化。

1.2.2 菌种保存

将纯化后的酵母接种于YPD液体培养基中于30℃下摇床培养24h，将菌液与50%vol甘油（121℃灭菌20min）按照1∶1混合后置于-4℃保存，备用。

1.2.3 酵母菌的初筛

1.酵母菌的产气能力实验[8-9]

采用杜氏管发酵法，用麦芽汁液体培养基注满杜氏管，将其倒置于装有10mL麦芽汁培养基的试管中，115℃灭菌15min。在无菌操作下接种活化后菌数达106CFU/mL的菌源0.1mL。将其置于30℃恒温培养箱中培养，每12h记录其在杜氏管中气泡占其体积的多少，直至杜氏小管内的气体体积不再变化。

2.酵母菌的产醇能力实验[10-11]

取活化后菌数达到106CFU/mL的菌源进行梯度稀释，取l0-3、l0-4和10-53个梯度的稀释液0.1mL涂布于YPD固体培养基中，每个菌株每个梯度各做3个平行。将其倒置于30℃恒温培养箱中培养。待长出可见菌落后，选择菌落数为100～300的平板倒入约15mL TTC上层培养基，使其均匀覆盖原来菌落。并将其置于30℃恒温培养箱中避光培养3h，并记录菌落的呈色（3个平行样中至少有2个呈色一致方能记录）。

1.2.4 WL培养基鉴定酵母菌[7，12-13]

将分离得到的酵母菌划线接种于WL营养培养基，于霉菌培养箱（28℃）中培养5d后观察，记录菌落颜色和形态。

1.2.5 酵母菌的耐受性实验

耐温性实验：将活化后菌数达106CFU/mL的菌源0.2mL接种于10mLYPD液体培养基中，然后分别置于15℃、25℃、30℃和35℃培养24h，在波长600nm下测定其吸光度值。耐乙醇、耐酸、耐糖、耐SO2实验：采用不同乙醇浓度体积分数（4%、8%、12%、16%）、酒石酸质量浓度（8%、10%、15%、20%）、葡萄糖质量浓度（10%、20%、25%、30%）、SO2质量浓度（100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L）的YPD液体培养基10mL，分别接种活化后菌数达106CFU/mL的菌液0.2mL，置于30℃恒温培养箱中培养24h后，在波长600nm下测定吸光度值。

2 结果分析

2.1 酵母的初筛

威代尔冰葡萄中分离得到24株酵母菌，将这24株酵母菌分别标号为V1、V2、V3…V24。

2.1.1 酵母菌的产气能力

将从威代尔冰葡萄中分离得到的24株酵母菌分别接种于含有杜氏管的麦芽汁培养基中培养，其产气能力结果如表1所示。

表1 酵母菌的产气能力结果Table 1 Results of gas production ability of yeasts

由表1可知，在36h时24株酵母产气均达到杜氏小管满体积，并且有7株酵母菌在最初的12h时产气已达到杜氏小管满体积，说明从威代尔冰葡萄中分离出的酵母菌发酵能力较强，有较高发酵效率。

2.1.2 酵母菌的产醇能力

从威代尔冰葡萄中分离得到的24株酵母菌的产醇能力如表2所示。将分离得到的24株酵母菌在YPD固体培养基上培养，形成的酵母菌落上覆盖一层TTC上层培养基。通过TTC显色剂对酵母代谢产物的呈色特性，筛选出产酒精能力强的酵母，筛选得到的酵母，其生长旺盛，同步性好，发酵能力强，接种后能较快地进入主发酵期[14]。在TTC上层培养基覆盖下，产酒精能力强的酵母菌落呈深红色，次之为粉红色[15]。由表2可知，TTC平板呈深红色的酵母菌有5株，呈粉红色的酵母菌有13株，呈微红色的有6株。

在葡萄酒的酿造过程中，酵母菌利用葡萄汁中的糖发酵产生酒精与CO2（C6H12O6→2CH3CH2OH+2CO2↑）。通过产气及产醇试验初筛出4株具有较强产气、产醇能力的菌株，分别为V1、V5、V9、V14。

表2 酵母菌的产醇能力结果Table 2 Results of alcohol production ability of yeasts

2.2 WL营养培养基鉴定酵母菌结果

CAVAZZA A等[16]研究表明，在葡萄酒自然发酵过程中出现的大多数典型的酵母菌种都可以用WL营养培养基进行区分，主要基于菌落颜色及菌落形态。将初筛出的5株酵母菌经WL营养培养基培养后，均为奶油色带绿色，突起、表面光滑、不透明、奶油状，WL营养培养基鉴定结果表明，V1、V5、V9、V14这4株酵母菌均为酿酒酵母。

2.3 酵母菌耐受性实验结果

2.3.1 酵母菌的温度耐性实验结果

冰葡萄酒的发酵温度一般在14℃～16℃，使冰葡萄酒能在低温下进行缓慢长时间发酵，以酿造出高品质的冰葡萄酒。将初筛得到的4株酵母分别接种于YPD培养基在不同的温度下培养24h后，在波长600nm处测定吸光度值，其结果见图1。由图1可知，4株酵母菌随着温度的升高，酵母菌的生长情况好转，而当温度超过30℃后，其生长情况有所降低。在15℃时，V5、V9的生长情况均好于对照葡萄酒酵母，说明V5、V9能耐受较高温度。

2.3.2 酵母菌的酸性耐受性实验结果

将初筛出的4株酵母菌及对照葡萄酒酵母接种于不同酒石酸含量的YPD培养基中，30℃下培养24h后，在波长600nm测定吸光度值，其结果见图2。酒石酸是葡萄汁中主要的有机酸，测定分离酵母的耐酸性主要考察其对耐酒石酸的耐受能力。图2结果表明，V9及V14在不同的酒石酸含量中的YPD培养基中生长情况均好于对照葡萄酒酵母，其中V9在酒石酸含量≥15.0g/L时其生长情况较其他酵母菌株好。

图2 不同酒石酸含量对酵母菌生长情况的影响Fig.2 Effect of different acid concentration on the growth of yeasts

2.3.3 酵母菌的糖度耐受性实验结果

由图3可以看出，4株酵母菌随着培养基中含糖量的增加，其吸光度值随之下降，可能是因为过高的糖含量抑制了酵母菌的生长。当葡萄糖含量从10%上升至20%时，V1和V14的吸光度值下降幅度较其他3株菌明显；而含糖量在2%以上时，酵母菌株V14的吸光度值几乎接近零点，表明V14在较高糖含量的培养基中基本不生长；其他3株酵母均较对照葡萄酒酵母耐糖性高。

图3 不同葡萄糖含量对酵母菌生长情况的影响Fig.3 Effect of different glucose levels on the growth of yeasts

2.3.4 酵母菌的酒精度耐受性实验结果

图4 不同乙醇含量对酵母菌生长情况的影响Fig.4 Effect of different alcohol concentration on the growth of yeasts

4株酵母菌的酒精度耐受实验结果由图4所示，葡萄酒的酒精度一般在8%vol～12%vol间，这是由于酒精度过高时，酵母菌即停止生长。由图4可知，在不同的酒精度含量的培养基中，酵母菌的变化趋势基本一致，即随着酒精度的增加其吸光度值下降，V5、V14两株酵母菌在含酒精的培养基中生长均缓慢，这表明这两株菌的耐酒精性能较其他3株酵母菌差。V1、V9与对照葡萄酒酵母有相似的耐酒精性能。

2.3.5 酵母菌的SO2耐受性实验结果

4株酵母菌的SO2耐受性实验结果由图5所示。葡萄酒生产过程中，需加入适量的SO2，以达到抑制有害微生物、抗氧化、护色等作用[5]，优良葡萄酒酵母要确保能在一定的SO2浓度下正常发酵。由图5可知，4株酵母菌与对照葡萄酵母的吸光度值均随着SO2浓度的增加先下降，然后基本维持在一稳定范围内。当SO2含量高于150mg/L时，4株酵母菌的生长情况相差不大，其生长情况均优于对照葡萄酒酵母菌，表明其具有一定的耐SO2性能。

图5 不同SO2含量对酵母菌生长情况的影响Fig.5 Effect of different SO2concentration on the growth of yeasts

3 结论

将威代尔冰葡萄中的酵母菌进行分离纯化后，通过酵母菌的产气能力实验和产醇能力实验初筛出4株产气及产醇能力优良的酵母菌，并通过WL营养培养基鉴别初筛出的4株酵母均为酿酒酵母。对将4株酿酒酵母与对照葡萄酒酵母进行耐温、耐酸、耐乙醇、耐糖和耐SO2实验，综合考虑其对温度、酸度、酒精度、糖度和SO2耐受性，分离得到的菌株V9具有良好发酵性能，具有阿坝地区特色冰葡萄酒的发酵潜能。对于所筛选酵母的分子生物学鉴定及其性能的稳定性还有待进一步研究。

[1]许青莲，邢亚阁，车振明，等.川西高原冰酒发酵中Pichia anomala的鉴定与耐受性研究[J].中国酿造，2013，31（8）：39-42.

[2]张 平，元贤哲，李新榜.冰葡萄酒威代尔的酿造工艺[J].中外葡萄与葡萄酒，2009（1）：54-56.

[3]李记明.酵母活性剂在葡萄酒酿造中的应用研究[J].酿酒科技，2001（4）：88-89.

[4]PURVA V,BANERJEE U C.Studies on the production of phytase by a newly isolated strain ofAspergillus niger var teighamobtained from rotten wood-logs[J].Proc Biochem,2002,38(2):211-217.

[5]程 超，韩北忠，陈晶瑜，等.本土葡萄酒酿酒酵母发酵性能的比较[J].中国酿造，2008，27（17）：8-10.

[6]张 鹏.四川泡菜中酵母菌的分离筛选及其应用研究[D].哈尔滨：东北农业大学硕士论文，2007.

[7]杨雪峰，苏 龙，刘树文.利用WL营养培养基鉴定葡萄酒中的相关酵母菌[J].中外葡萄与葡萄酒，2006（4）：4-7.

[8]崔铁忠.柿子果酒酵母菌的分离、筛选及其应用研究[D].北京：中国农业大学硕士论文，2005.

[9]隆文娟，王 捷，姚玉军，等.沙棘果酒酿造中优良酵母菌的筛选及鉴定[J].工业微生物，2011，41（5）：27-31

[10]单 艺，张兰威，崔宏斌.传统法酿造糯米酒中酵母菌的筛选及发酵性能研究[J].食品工业科技，2007，28（8）：88-93.

[11]毛志群.高产酒精酵母的筛选及鉴定[J].食品与发酵工业，2003，29（3）：50-53.

[12]薛军侠，徐艳文，杨 莹，等.WL培养基在酿酒酵母筛选中的应用[J].中国酿造，2007，26（9）：37-39.

[13]王凤梅，马利兵，刘树文.土默川平原葡萄酒相关酵母的分离与鉴定[J].四川食品与发酵，2008，44（5）：62-64.

[14]王 梅.TTC在黄酒酵母选育中的应用[J].酿酒，2001（5）：62-64.

[15]汪志君，高 庆，方维明，等.紫外诱变筛选低高级醇和双乙酰含量的啤酒酵母[J].中国酿造，2005，24（1）：13-17.

[16]CAVAZZA A,GRANDO MS,ZJNI C.Rilevazionedella flora microbica dimosti e Vini[J].Vignevini,1992(9):17-20.