电针对阿尔茨海默病模型大鼠海马区蛋白激酶C和β-淀粉样蛋白表达的影响

张海燕 刘忠锦 陈志伟 (齐齐哈尔医学院组织学与胚胎学教研室，黑龙江 齐齐哈尔 6006)

阿尔茨海默病(AD)占痴呆总数的50% ～60%〔1〕。其特征是海马、额叶、颞叶等脑区出现老年斑(SP)和缠结一起神经元及大量突触连接的消失。临床表现为学习记忆障碍，智力衰减，常伴有人格劣化。AD的治疗现代主要是延缓AD的发展和增强神经元的功能恢复能力，来进一步改善症状。本实验对大鼠海马的蛋白激酶C(PKC)、β-淀粉样蛋白(Aβ)测定，旨在证明电针能改善AD大鼠的记忆能力，并进一步探求治疗AD的新途径。

1 材料与方法

1.1 材料 健康SD雄性大鼠60只，体重180～200 g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供(批号:2010002)。在实验室稳定条件下饲养1 w。链脲佐菌素(STZ，Introvengen公司 批号:I5025)、氢溴酸加兰他敏(陕西森弗生物技术有限公司批号:100050-197801)、Aβ、PKC免疫组化试剂盒(武汉博士德生物技术有限公司批号:200810)、脑立体定位仪(NARISHIGE SN-2型)、Morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所)、G6805-II型电针治疗仪(上海医疗器械厂)、华佗牌针灸针(苏州医疗用品厂有限公司)。

1.2 动物造模 大鼠经10%水合氯醛(4 ml/kg)腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定位仪。常规消毒皮肤，正中矢状切口，分离骨膜锥颅器钻开颅骨，暴露硬脑膜。微量注射器每侧侧脑室各注射STZ10 μl，注射前将STZ溶于生理盐水，浓度为10%。参照《大鼠脑立体定位图谱》〔2〕:前囟1.5 mm，矢状缝左右旁开1.5 mm，脑表面下3.5 mm，用微量注射器将STZ在2 min内缓慢注入，留针5 min，充分浸润局部组织，缓慢拔出微量注射器。第3天重复注射，剂量同前，正常组不予处置，模型对照组操作同前。

1.3 动物分组 所有大鼠经第1天的水迷宫试验，排除先天愚笨者(不会游泳及原地打转者);再从剩余60只大鼠中随机分5组，每组12只。全部实验动物用相同的饲料喂养，喂养过程中所使用的器皿均为非铝制品。正常组:给予常规饲养。模型对照组:每侧侧脑室各注射生理盐水10 μl。术后常规饲养。模型组:造模后常规饲养。电针组:第2次水迷宫测试结束24 h后，电针组用0.35 mm×25 mm毫针针刺“百会”穴，斜刺约0.5寸，“涌泉”直刺0.3寸。“百会”穴、“涌泉”穴连接电针治疗仪，选择断续波，频率为20 Hz，电压为2 V，强度以肢体轻微抖动为度，用0.35 mm×25 mm毫针针刺大鼠双侧“太溪”穴，直刺进针3 mm，双侧“肾俞”穴，直刺进针5 mm，双侧“足三里”穴，直刺进针4 mm间歇5 min捻转一次，平补平泻。每日1次，时间30 min。7 d为一疗程，间歇1 d，治疗3个疗程后进行行为学测试。西药组:氢溴酸加兰他敏每日0.5～1 mg/kg体重。

1.4 取材 治疗结束后第2天，每组随机选取10只大鼠大鼠用10%水合氯醛(4 ml/kg)腹腔注射，麻醉后立即开胸暴露心脏，经左心室插管至主动脉，同时剪开右心耳，快速灌注0.85%生理盐水，至肝脏变白改灌注液为4%多聚甲醛，灌注时间约30 min，见大鼠尾巴、四肢僵硬视为满意，取脑并分离海马，放入4%的多聚甲醛溶液中固定过夜，之后进行石蜡包埋，组织切片，HE染色，免疫组织化学染色。PKC、Aβ免疫反应阳性产物为棕黄色点状颗粒，主要分布在胞质。采集免疫组化染色图像，用Imagepro-Plus6.0分析软件进行图像分析，每张切片区4个视野测定海马组织中阳性产物的积分光密度值(IOD)和阳性细胞数。

2 结果

2.1 治疗后各组海马区PKC蛋白表达比较 正常组、模型对照组PKC蛋白有较高表达，模型组PKC蛋白表达水平显著降低，治疗后西药组、电针组与模型组比较有显著性差异(P＜0.05)，见表1，图1。

图1 各组大鼠海马区PKC蛋白表达(DAB，×400)

2.2 治疗后各组海马区Aβ蛋白表达比较 正常组、模型对照组Aβ蛋白有较低表达，模型组Aβ蛋白表达水平显著升高，治疗后西药组、电针组较模型组表达减少(P＜0.05)。见表2。

表1 各组海马PKC蛋白表达(± s，n=10)

表1 各组海马PKC蛋白表达(± s，n=10)

与模型组比:1)P＜0.05，下表同

组别 积分光密度值 表达阳性细胞数(个/高倍视野)正常组 0.324±0.0621) 31.85±14.631)模型对照组 0.329±0.0651) 30.72±15.191)模型组 0.203±0.071 17.25±3.26西药组 0.304±0.0591) 27.31±10.241)电针组 0.301±0.0641) 26.47±11.631)

表2 各组海马Aβ蛋白表达(± s，n=10)

表2 各组海马Aβ蛋白表达(± s，n=10)

组别 积分光密度值 表达阳性细胞数(个/高倍视野)正常组 0.168±0.0071) 10.87±3.151)模型对照组 0.165±0.0041) 11.09±3.281)模型组 0.239±0.012 25.31±2.46西药组 0.179±0.0061) 20.52±2.631)电针组 0.181±0.0081) 21.94±2.701)

3 讨论

祖国医学认为，肾藏精，生髓，通于脑，“脑为位髓海”，“脑为元神之府”髓海充实，则神清气朗，耳聪目明。AD常由年老体衰，肾精不足、髓海失养，加之痰浊瘀血阻滞脑窍，神明被蒙，导致记忆衰退，反应呆钝等症。历代医家已意识到“肾虚血瘀、浊毒内生、损伤脑髓”是AD发病的重要机制，本实验针刺治疗的原则是“补肾活血、化痰通络、醒神开窍”。在上述治疗原则的指导下选出“百会”、“大椎”、“太溪”、“肾俞”、“足三里”组成针灸治疗处方。

AD的病理学特征是大脑皮质和海马区域神经原纤维缠结(NFT)、SP形成以及神经元缺失，其中SP主要成分为Aβ，而NFT主要成分为异常过度磷酸化的 Tau蛋白形成。Aβ在AD的发病机制中具有核心的作用，是AD形成和发展的关键因素。PKC对AD的Aβ和Tau蛋白形成起重要作用。PI信号系统参与调节β-淀粉样蛋白前体(APP)的正常降解过程，水解所产生的DAG使PKC激活，激活的PKC从而使Aβ生成减少。Cordey等〔3〕研究证明经典的PKC亚型能够阻止Aβ诱导的神经细胞死亡。另一方面，Forlenza等〔4〕研究指出，PKC抑制糖原合成激酶-3β(GSK-3β)磷酸化Tau蛋白的作用，从而可减少Tau蛋白磷酸化。邢伟等〔5〕通过研究发现慢性铝暴露影响大鼠海马PKC mRNA和PKC蛋白表达，使PKC活性降低，导致大鼠海马CA1区长时程形成，从而影响学习记忆功能。该研究表明，PKC活性可以影响神经细胞的学习记忆功能。PKC与突触可塑性及长时程增强效应(LTP)的形成密切相关。PKC的激活是LTP产生的重要条件之一。针刺通过影响中枢神经系统胆碱能神经系统的功能，抗氧化以及改善突触形态可塑性及LTP，来直接或间接提高AD大鼠的学习记忆能力〔6～8〕。

综上所述，电针治疗可降低Aβ在脑内的表达，激活PKC表达，在一定程度上阻止神经元细胞凋亡过程;电针可引起激活PKC抑制Aβ和 Tau蛋白形成，可间接减少NFT、SP形成，从而起到保护脑细胞、延缓衰老的作用。这可能是针刺能有效地防治老年性痴呆的作用机制之一。

1 Blennow K，de LM，Zetterberg H.Alzhemier’s disease〔J〕.Lancet，2006;368(9533):387-403.

2 包新民，舒斯云.大鼠脑立体定位图谱〔M〕.北京:人民卫生出版社，1994:20-40.

3 Cordey M，Pike C.Conventional protein kinase C isoforms mediate neuroprotection induced by phorbol ester and estrogen〔J〕.Neurochemisry，2006;96(1):204-17.

4 Forlenza OV，Spink JM，Dayanandan R，et al.Muscarinic agonists reduce tau phosphorylation in non-neuronal cells via GSK-3beta inhibition and in neurons〔J〕.J Neural Transm，2000;107(10):1201-12.

5 邢 伟，王 彪，文 涛，等.铝暴露对大鼠海马蛋白激酶Cr亚型影响〔J〕.中国公共卫生，2007;23(3):305-7.

6 刘智斌，牛文民，杨晓航，等.嗅三针对老年痴呆大鼠学习记忆功能及海马胆碱乙酰化酶、乙酰胆碱酯酶活性的影响〔J〕.针刺研究，2009;34(1):48-51.

7 彭 静，曾 芳，何宇恒，等.电针对SAMP 8小鼠海马线粒体作用的研究〔J〕.针刺研究，2007;32(6):364-7.

8 唐 勇，尹海燕，曾 芳，等.针刺原位诱导阿尔茨海默病海马内源性神经干细胞的思考〔J〕.中西医结合学报，2005;3(5):351-3.