Klotho基因多态性与高血压左室肥厚的关系

李 龙 李 莉 崔天祥 赵 狄 (郑州大学第二附属医院心血管内科，河南 郑州 450000)

Kuro-o等〔1〕在1997年研究自发性高血压大鼠时偶然发现了一个与人类衰老相关的基因——klotho基因，以后确认klotho基因缺失鼠(kl-/-)的表型类似人类的衰老表现，包括血压升高、寿命缩短、动脉硬化、内皮功能障碍、肌肉萎缩、认知障碍、骨质疏松等。研究发现，随着年龄的增加，klotho基因的表达量逐渐降低，高血压患病率逐渐升高〔2〕，二者之间可能存在相关。Rhee等〔3〕发现klotho基因启动子G395A多态性影响klotho蛋白表达。血浆klotho蛋白水平降低易导致高血压早期肾损害及高血压脑损害，但klotoh基因与高血压左室肥厚的关系尚未见文献报道。本文旨在探讨klotho基因G395A多态性与高血压合并左室肥厚的关系。

1 对象与方法

1.1 对象 来自于2012年1～8月在郑州大学第二附属医院门诊及住院的原发性高血压患者，诊断标准按照2010年中国高血压防治指南。所有患者均排除继发性高血压、脑血管病、糖尿病、泌尿系统感染及肝肾功能不全等，且采血前均停用降压药物2 w。根据高血压患者是否合并左室肥厚，将其分为单纯高血压组(A组，76例)，高血压合并左室肥厚组(B组，82例)。69例健康成人为对照组(C组)。各组临床资料见表1。

1.2 方法

1.2.1 左室肥厚诊断依据 采用东芝240型彩色多普勒超声仪，由同一操作者按美国超声协会推荐的测量方法，连续测量3个心动周期的左心室舒张末期内径(LVDd)、舒张期左室壁厚度(PWT)及舒张期室间隔厚度(IVST)，取其平均值。体表面积(BSA)=〔0.006×身高(cm)+0.012 8×体重(kg)〕-0.152 9。左室质量指数(LVMI)根据Devereux公式计算，即LVMI(g/m2)={0.8 ×1.04〔(LVDd+IVST+PWT)3-LVDd3〕+0.6}/BSA。符合以下一项以上标准者为LVH:(1)PWT≥12 mm;(2)IVST≥12 mm;(3)LVMI男性 ＞125 g/m2，女性＞120 g/m2。

1.2.2 标本采集 所有研究对象空腹12 h以上，采集清晨静脉血5 ml入EDTA抗凝管中，离心10 min(2 000 r/min)，取血浆，-70℃保存。

1.2.3 单核苷酸多态性(SNP)检测 DNA提取:采用常规酚-氯仿法提取外周血白细胞基因组DNA，提取试剂盒由大连宝生物工程有限公司提供。引物设计:通过美国国家生物信息中心的GenBank获取基因序列及相应位点的SNP信息。采用Primer5.0软件自行设计等位基因特异性引物。设计一条等位基因特异性上游引物，同时设计一条3'末端碱基与检测SNP位点的突变型或野生型等位基因碱基互补的下游引物即等位基因特异性下游引物。Klotho基因 G395A上游引物::5'-AATCGGCTCCAGCAATGTCCAG-3'，Tm 60.0℃，GC(%)54.5%;下游引物:如果为G等位基因5'-AGAAAAGTCGCCGACCAACTTTC-3'，Tm 58.4℃，GC(%)47.8%;如果为 A 等位基因 5'-GAGAAAAGGCGACGACCATCTTTT-3'，Tm 58.7℃，GC(%)45.8%。设计引物均由中国大连宝生物技术有限公司合成。PCR采用 20 μl反应体系，其中 10 倍缓冲液 2 μl，dNTP 0.125 μmol/L，MgCl22.0 mmol/L，引物浓度为 0.25 μmol/L，Taq DNA聚合酶0.5 IU，Templet DNA 100 ng。反应条件为:G等位基因94℃ 5 min预变性，94℃变性30 s、63℃退火30 s、72℃延伸30 s，共35个循环，72℃延长10 min;A等位基因94℃5 min 预变性，94℃变性 30 s、61℃ 退火 30 s、72℃ 延伸 30 s，共35个循环，72℃延长10 min。取PCR产物5 μl，1.5%琼脂糖凝胶-溴乙锭染色法电泳，凝胶成像系统观测并记录结果。Klotho基因G395A多态性等位基因型为AA、GA、GG三种形式;其PCR扩增产物片段长147 bp。

1.2.4 生化指标检测 采用日立7600全自动生化分析仪测定血浆总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDLC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、空腹血糖(FPG)、血肌酐(Scr)等生化指标。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行处理，用Hardy-Weinberg平衡定律检验样本的群体代表性;计量资料以±s表示，组间比较采用LSD-t检验。各组基因型及等位基因比较采用χ2检验及χ2分割检验，采用Pearson分析相关性。

2 结果

2.1 一般临床资料比较 三组间性别、TC、HDL-C、LDL-C、FPG、TG、Scr比较，差异均无统计学意义，见表1。

2.2 三组klotho基因G395A位点多态性分析 本研究三组klotho基因型分布符合Haldy-Weinberg平衡。三组间Klotho基因G395A位点的多态性分布频率有显著差异(χ2=16.976，P＜0.05)。单纯高血压组和对照组的基因型分布差异无统计学意义(P＞0.05)，A等位基因频率高于对照组(χ2=3.863，P＜0.05)。高血压合并左室肥厚组和对照组的基因型分布差异有统计学意义(χ2=14.307，P＜0.05)，A等位基因频率高于对照组(χ2=16.314，P＜0.05)。单纯高血压组和高血压合并左室肥厚组基因型分布差异无统计学意义(P＞0.05)，等位基因分布差异有统计学意义(χ2=4.586，P＜0.05)。见表2。

表1 研究对象一般情况比较(±s)

表1 研究对象一般情况比较(±s)

项目 A组(n=76) B组(n=82) C组(n=69)40/36 44/38 38/31 TC(mmol/L) 4.74±1.03 4.79±1.05 4.69±0.99 LDL-C(mmol/L) 3.09±1.05 3.15±1.03 3.07±1.09 HDL-C(mmol/L) 1.25±0.35 1.23±0.37 1.26±0.38 FPG(mmol/L) 5.59±1.87 5.24±1.99 5.47±2.01 TG(mmol/L) 1.67±1.08 1.65±1.15 1.76±1.26 Scr(μmol/L)性别(男/女)87.98±7.05 92.45±6.78 94.67±7.42

表2 三组基因型及等位基因分布〔n(%)〕

3 讨论

Klotho基因是近年来发现的一个抗衰老基因，人和小鼠的klotho基因位于染色体13q12区域，大鼠位于12q12区域〔4〕。Klotho基因在人体内编码的蛋白分为膜结合型蛋白和分泌型蛋白两种，分泌型蛋白的表达量明显高于膜型蛋白。Saito等〔5〕利用腺病毒介导将klotho基因导入动脉粥样硬化模型鼠(OLETF)体内(伴有高血压、高血脂、高血糖、肥胖)，发现klotho基因可改善血管内皮功能，增加一氧化氮(NO)的产生，降低血压，防止内膜增厚和血管纤维化。血浆NO水平随着klotho蛋白浓度的升高而增加，两者存在正相关。

近年来klotho基因G395A位点多态性与高血压的关系倍受关注。Wang等〔6〕研究发现klotho G395A多态性与原发性高血压密切相关，并发现该位点的基因突变可能是该基因表达的一种潜在调节靶点。Rhee等〔7〕在研究韩国女性G395A位点基因多态性与高血压的关系时，发现A等位基因携带者的收缩压明显高于非A等位基因携带者，且经过体重指数、年龄校正后仍有显著差异。本研究发现，高血压组A等位基因频率高于对照组，提示klotoh基因G395A多态性可能与原发性高血压的发生有关，AA基因型可能易患高血压，A等位基因可能是高血压的易感基因，本研究与Rhee等〔7〕的研究结果相符。单纯高血压组G等位基因频率高于高血压左室肥厚组，提示G等位基因可能对高血压左室肥厚的发生具有保护作用。总之，Klotho基因G395A多态性与原发性高血压及左室肥厚的发生有关，改变G395A位点的表达能否减少高血压、左室肥厚的发生及其作用机制有待进一步研究。

1 Kuro-o M，Matsumura Y，Aizawa，H，et al.Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling aging〔J〕.Nature，1997;390(6655):45-51.

2 Ong KL，Cheung.BMY，Man YB，et al.Prevalence，awareness，treatment and control of hypertension among United States adults 1994-2004〔J〕.Hypertension，2007;49(1):69-75.

3 Rhee EJ，Oh KW，Yun EJ，et al.Relationship between polymorphisms G395A in promoter and C1818T in exon 4 of the Klotho gene with glucose metabolism and cardiovascular risk factors in Korean women〔J〕.J Endocrinol Invest，2006;29:613-8.

4 Matsumura Y，Aizawa H，Shiraki-Iida T，et al.Identification of the human klotho gene and its two transcripts encoding membrane and secreted klotho protein〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，1998;242(3):626-30.

5 Saito Y，Nakamura T，Ohyama Y，et al.In vivo klotho gene delivery protects against endothelial dysfunction in multiple risk factor syndrome〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2000;276(2):767-72.

6 Wang HL，Xu Q，Wang Z，et al.Potential regulatory single nucleotide polymorphism in the promoter of the Klotho gene may be associated with essential hypertension in the Chinese Han population〔J〕.Clin Chim Acta，2010;411(5-6):386-90.

7 Rhee EJ，Oh KW，Lee WY，et al.The differential effects of age on the association of Klotho gene polymorphisms with coronary artery disease〔J〕.Metabolism，2006;55:1344-51.