促炎基因ALOX5AP多态性与脑卒中伴动脉粥样硬化患者功能恢复的相关性

王建华 (唐山市工人医院神经内科，河北 唐山 063000)

动脉粥样硬化是导致脑卒中的重要因素，流行病学研究显示了多种重要环境和遗传危险因子如脂质代谢异常、高血压、糖尿病、肥胖等均同动脉粥样硬化相关联〔1〕。炎症作用是一个关键性的致病机制。国内关于脑卒中综合危险度评估及干预方案的研究中发现5-脂氧酶激活蛋白基因变异对脑卒中伴动脉粥样硬化有一定的影响。本研究现将针对促炎基因ALOX5AP多态性同脑卒中伴动脉粥样硬化患者功能恢复的关系进行分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2007年5月至2009年12月我院收治的脑卒中患者78例。其中35例合并动脉粥样硬化，43例单纯脑卒中患者中男性26例，女性17例，年龄56～71〔平均(63.5±12.4)〕岁;合并动脉粥样硬化患者中男性21例，女性15例，年龄58～72〔平均(61.2±15.3)〕岁。脑卒中入选标准:符合第四届全国脑血管会议诊断标准，并经过CT/MRI确诊为脑卒中，患者存在一定的运动功能障碍，但生命特征平稳。格拉斯哥昏迷评分＞8分，且为首次发病，首次发病后未见明显功能障碍。动脉粥样硬化病例入选标准:经冠状动脉造影证实左前降支，左回旋支，右冠状动脉中有至少1支内径狭窄超过50%。病例排除标准:排除短暂性脑缺血发作、四肢瘫痪、病情恶化、蛛网膜下腔出血者、痴呆、合并严重肝肾心脏疾病、肌肉骨骼疾患、合并有活动性肝病、充血性心力衰竭、恶性肿瘤、呼吸功能衰竭的严重疾病者。两组患者年龄，性别等基线资料进行比较结果显示差异不具有统计学意义，表明两组间具有可比性(P＞0.05)。

1.2 方法 采用聚合酶链反应限制性片段长度内切法检测患者ALOX5AP基因2354T/A与16699A/G多态性。神经功能缺损评分(CNS)，FUGL-MEYER运动功能积分法(FMA)以及修订巴氏指数(MBI)评价两组患者的功能。运动功能:简式Fugl-Meyer评分(FMA)。运动总分为100分，上肢运动最高分值66分，下肢运动最高分值34分。运动积分＜50分Ⅰ级，为严重运动障碍;50～84分为Ⅱ级，明显运动功能障碍;85～95分为Ⅲ级，中度运动功能障碍;96～99分Ⅳ级，为轻度运动功能障碍。日常生活能力采用MBI。0～20分为极严重功能缺陷，25～45分严重功能缺陷，50～70分为中度功能缺陷，75～95分轻度功能缺陷。正常100分。ALOX5AP基因检测方法:抽取两组患者空腹12 h外周静脉血，及时分离标本，4 h内完成测定。所有受试者于冠脉造影前动脉鞘管采血5 ml装入EDTA抗凝管中30 min内离心，血浆血细胞分离。储存于-70℃冰箱内。3个月内使用盐析法提取全血基因组DNA。将抽血管血球带倒入离心管后加溶液冰浴10 min，离心15 min，弃上清管内沉淀吹匀，加蛋白酶K，37℃过夜，再于管内加2.5 ml氯化钠，至完全盐析。离心15 min，去上清加氯仿混匀5 min，离心15 min吸出上清至50 ml离心管。上清液中加入无水乙醇，充分混匀DNA，挑出沉淀至1.5 ml离心管中，并加入75%乙醇洗两遍，吸出乙醇溶液开盖晾干，加入TE，于-70℃下保存。DNA提取后再进行5-脂氧合酶基因的扩增，限制性内切酶进行酶切两基因点。

1.3 统计学方法 使用SPSS15.0统计软件，计量资料使用±s表示，计数资料采用率的形式，计量资料的两组间比较采用t检验，计数资料采用χ2检验。

2 结果

2.1 两组患者ALOX5AP基因频率比较 ALOX5AP基因2354T/A，16699A/G于脑卒中合并动脉粥样硬化组中呈高表达，显著高于单纯脑卒中组(P＜0.05)。见表1。

2.2 两组患者功能评分 脑卒中合并动脉粥样硬化患者的功能评分较单纯脑卒中患者差(P＜0.05)。见表1。

表1 两组ALOX5AP等位基因频率及神经功能评分(±s)

表1 两组ALOX5AP等位基因频率及神经功能评分(±s)

与脑卒中组比较:1)P＜0.05

43 12.4 8.3 17.34±8.04 31.52±6.34 29.11±6.23合并动脉粥样硬化组 35 35.21) 24.81) 20.02±9.121) 27.53±6.671) 24.16±5.351)CNS MBI FMA单纯脑卒中组组别 n 2354T/A等位基因频率(%)16699A/G等位基因频率(%)

3 讨论

研究者在筛查5-LO抑制剂时发现了中性粒细胞中的白三烯合成的抑制剂，而MK-886于细胞裂解实验中显示5-LO并无抑制作用，对于酶的提纯也无明显抑制作用，使用亲和柱MK-886放射光亲和类似物法证明在大鼠及人白细胞中MK-886的分子可以同18 kD膜蛋白结合〔2〕。Dixon等〔3〕用人骨肉瘤细胞进行实验研究，在单独表达5-LO时发现仅在5-LO和18 kD蛋白功能表达的培养细胞中才可以合成白三烯。由此提示18 kD蛋白对于细胞内的5-LO活性是必需的物质，因此，将该类蛋白命名为花生四烯酸5-脂氧合酶激活蛋白。

5-脂氧合酶是白三烯类代谢产物生成的关键酶，它催化花生四烯酸转化为5-氢过氧化二十碳四烯酸进一步氧化成为白三烯，白三烯水化为白三烯B4或在其他酶类作用下催化生成LTC4参与炎性反应。其中LTB4是潜在中性白细胞、巨噬细胞以及其他炎症细胞参与炎症反应的化学诱导剂，它可以加速化学运动型增加血管内皮黏附是高活性物质。胱氨酰白三烯可以增加血管的通透性及平滑肌的收缩，它的多少也同支气管和血管收缩、哮喘的发生有关〔4〕。5-脂氧合酶激活蛋白分子量为18 kD，其蛋白包含3个跨膜区与2个亲水环，FLAP位于包膜或内质网上它是激活5-脂氧合酶活性所需。它是5脂氧合酶同膜的结合部位，除了可以参与5-脂氧合酶与膜的结合外也可以作为氨基酸合成蛋白的底物。

ALOX5AP基因于13号染色体 13Q12，基因长度约为31 kb，有5个较小的外显子和4个内含子，该基因编码区含有多核苷酸多态性，且其突变率较高，推测可能这些SNP中存在功能性突变，从而影响5-脂氧合酶激活蛋白的合成或影响其活性。既往有大量关于5-脂氧合酶激活蛋白调节5-脂氧合酶的活性，以及ALOX5AP基因变异对于5-脂氧合酶代谢途径的影响。Helgado等〔5〕首先报道了ALOX5AP基因可以甲素白三烯的形成，刺激一些其他参与炎症动脉硬化的路径，并且确认ALOX5AP染色体的13q12-13位点可能是增加脑卒中患者发病危险的重要因素。虽然关于ALOX5AP报道的研究很多，但其变异同动脉粥样硬化疾病的发生发展仍然缺乏相关研究。Helgado等〔5〕进一步研究发现，ALOX5AP，2354AA基因增加的人群中会增加1.55倍脑梗死的发病风险。但具体其同脑梗死发生的关联机制并不明确。研究表明，FLAP/5-LO通道多于白细胞中表达，可以增加酶活性，促进炎性因子白三烯的释放，增强血管通透性及血管的收缩以及单核细胞，血管内皮的黏附作用。如此，在斑块的炎性损伤区域将存在一个恶性循环会增加血管损伤的风险性。ALOX5AP在多数研究中已经被证实可以通过致动脉粥样硬化作用引发脑梗死，那么我们推测它在导致动脉粥样硬化作用的发病过程中也起到一定作用。

本研究提示ALOX5AP基因的多态性和脑卒中合并动脉粥样硬化患者的功能恢复具有一定的关联，但本研究样本量过少，相关的遗传及环境也是影响试验结果的重要因素，还需要进一步研究。

1 张伟丽，石 佳，杨晓敏，等.ALOX5AP基因多态2354T/A和MTHFR基因多态677C/T的协同作用显著增加脑梗死的易患性〔J〕.中国分子心脏病学杂志，2005;5(1):395-400.

2 Ro M，Kim S，Pyun JA，et al.Association between arachidonate 5-lipoxygenase-activating protein(ALOX5AP)and lung function in a Korean population〔J〕.Scand J Immunol，2012;76(2):151-7.

3 Dixon WP，McNeish JD，Griffiths RJ，et al.Induction of hepatic microsomal drug-metabolizing enzymes by inhibitors of 5-lipoxygenase(5-LO):studies in rats and 5-LO knockout mice〔J〕.Toxicol Sci，2001;63(1):15-21.

4 高 强，杨春晓，慕璐岩，等.ALOX5AP基因突变与缺血性脑卒中的关系〔J〕.临床神经病学杂志，2007;20(5):326-8.

5 Helgado Lapenna A，Laxton RC，Ye S，et al.Comment on:a promoter polymorphism(rs17222919，-1316T/G)of ALOX5AP is associated with intracerebral hemorrhage in Korean population〔J〕.Prostagl Leukotr Essent Fatty Acids，2012;86(3):135-6.