HPLC检测青霉素钠和头孢他啶残留方法的研究

袁果园 王云帆 熊伟

(重庆科技学院安全工程学院，重庆 401331)

我国每年抗生素原料产量约为21万t，其中有9.7 万 t用于畜牧养殖业［1］。王云鹏等人［2］对国内5省市进行的养殖业抗生素的使用情况调查表明饲养场滥用抗生素现象相当严重。虽然使用抗生素有可能降低养殖成本，但长期使用抗生素可诱导耐药菌的出现［3］。在肉制品中，抗生素残留量不是很大，但人们长期食用后，可在体内大量蓄积，给人体健康带来危害［4］。在污水处理厂和废水中，已检测出耐药性和多种耐药性细菌，这些细菌很可能通过污水灌溉、污泥施肥等方式进入食物链［5］。残留在饮用水中的抗生素，长期饮用将降低人体免疫力［6］。部分药物有致癌、致突变等作用，严重干扰了人体各项生理功能［7］。

抗生素中β－内酰胺类是一种种类繁多的抗生素，包括临床最常用的青霉素与头孢菌素等。此类抗生素因杀菌活性强、毒性低、适应症广及临床疗效好等优点而被广泛应用于治疗和预防各种疾病。随着人们生活和卫生水平的不断提高以及β－内酰胺类抗生素逐渐成为抗菌的重点药物，β－内酰胺类的需求量将继续增长，这将给国内的β－内酰胺类酰胺类抗生素产品提供更为广阔的市场，且在今后相当长的时期内，仍是抗生素发展的主流。因此，研究一种快速精确检测食品和环境中多种抗生素残留的方法是非常必要的。常用的TTC检测法［8］和纸片检测法［9］的精密度和准确度不高，且易受其他抗菌药物的干扰;免疫分析法［10］和试剂盒法［11］的检测时间较长，样品前处理较复杂，同时也很难进行现场检测;化学发光法［12］和荧光分光光度法［13］的样品预处理复杂，流程繁琐，设备昂贵，需要专业技术人员等，很难实现现场检测和推广。

HPLC是在经典液相色谱的基础上，采用了由全多孔或非多孔高效微粒固定相制备的色谱柱，有高压输液泵输送流动相，用高灵敏度检测器进行检测，实现了高柱效、高选择性、高灵敏度的快速分析，并成为有机物定量分析的主要分析工具。本文以β－内酰胺类药物——青霉素钠和头孢他啶为样本，通过优化HPLC的检测条件，来实现快速、准确的检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Science高效液相色谱系统，包括P680高压梯度溶剂输送泵，AD25紫外—可见检测器和LC20柱温箱;Ultimate XB－C18色谱柱(4.6 mm×250 mm Column 5－Micron);超纯水系统;针筒式微孔滤膜过滤器(天津腾达过滤器件厂);450 nm微孔滤膜(上海新亚有限责任公司);数控超声波清洗器(南京垒君达超声电子设备有限公司);PHS－3C型实验室PH计(荣庆计量检测仪器有限公司);砂芯过滤装置(天津市领航实验设备有限公司);真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)。

甲醇，色谱纯(成都市科龙化工试剂厂);磷酸，色谱纯(天津光复精细化工研究所)。

1.2 溶液的配制

准确称取0.025 g青霉素钠和头孢他啶，于25 mL容量瓶中，加入10 mL超纯水，摇匀，待完全溶解，冷却后，用超纯水定容至刻度，并摇匀，配制成浓度为1 mgmL的青霉素钠和头孢他啶标准储备液，密封，4℃冷藏保存。

取480 mL超纯水于烧杯中，加入2 mL磷酸，摇匀，用过滤器过滤，滤膜是450 nm微孔滤膜，得到流动相A。

1.3 色谱条件

流动相A为水磷酸溶液;流动相B为甲醇。流速为1 mLmin，进样量为 10 μL，柱温为 25 ℃。

2 结果与讨论

2.1 流动相组成配比的优化

青霉素钠流动相组成配比中甲醇分别为30%、35%、40%的色谱图分别见图1、图2、图3。出峰时间分别为8.507、7.242、5.560 min。在多种成分的检测中，应尽量使出峰在溶剂峰之后，取保留时间较短为好，因此甲醇为30%时为最优流动相配比。

图1 青霉素钠流动相组成配比中甲醇为30%的色谱图(出峰时间为6.8 min)

图2 青霉素钠流动相组成配比中甲醇为35%的色谱图(出峰时间为4.2 min)

图3 青霉素钠流动相组成配比中甲醇为40%的色谱图(出峰时间为8.0 min)

头孢他啶流动相组成配比中甲醇分别为25%、30%、35%的色谱图分别见图4、图5、图6。出峰时间分别为5.012、3.900、3.333 min，因此甲醇为25%时为最优流动相配比。

图4 头孢他啶流动相组成配比中甲醇为25%的色谱图(出峰时间为4.6 min)

图5 头孢他啶流动相组成配比中甲醇为30%的色谱图(出峰时间为3.7 min)

图6 头孢他啶流动相组成配比中甲醇为35%的色谱图(出峰时间为3.2 min)

2.2 检测波长的优化

不同波长下检测得到的青霉素钠和头孢他啶的液相图谱峰面积见表1。在282 nm时青霉素钠的色谱峰面积最大，出峰最明显，因此282 nm为最佳检测波长。在260 nm时头孢他啶的色谱峰面积最大，出峰最明显，因此260 nm为最佳检测波长。

2.3 线性关系、检出限和重复性

实验结果表明，在10～1000 ngmL浓度范围内，线性关系R2均大于0.990。采用3倍信噪比计算检出限，其中青霉素钠和头孢他啶检出限分别是3.5 ngmL 和6.5 ngmL。采用 10 倍信噪比计算定量下线，结果见表2。配制10 ngmL和25 ngmL标准溶液，分别连续进样4次，峰面积相对标准偏差(RSD)均小于2%，重现性较好。

表1 青霉素钠和头孢他啶在不同波长下的峰面积

2.4 实际样品的测定

图7和图8分别为市售某厂家生产的青霉素钠和头孢他啶成品药在优化条件下浓度为1 mgmL的检测图谱。

表2 抗生素校正曲线回归分析、检出限和定量下限

图7 成品青霉素钠的检测图谱

图8 成品头孢他啶的检测图谱

图7、图8表明在该条件下能够检测出2种物质。峰面积分别为830和1151，通过计算，该成品药青霉素钠和头孢他啶的有效浓度分别为29 ngmg和16 ngmg，因此，成品药青霉素钠和头孢他啶的有效含量分别为2.9%和1.6%。

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