耐甲硝唑幽门螺杆菌的差异蛋白质组学

吕丽艳 夏美玲 姚淑娟 刘伯阳 温达静

胃癌的发病率和病死率有着明显的地域性，主要分布在亚洲的一些国家，例如日本、中国和其他东亚国家，有较大的危害性[1]。而感染幽门螺杆菌（Hp）是胃溃疡、十二指肠溃疡及原发性胃癌的主要致病因素。根治Hp是预防溃疡和胃癌的主要临床策略。甲硝唑作为以往最有效的治疗药物在临床出现较多耐药病例，这给Hp的防治带来较大麻烦[2]。发现耐药菌株和正常感染菌株的差异，寻找更为有效的治疗策略成为当前研究者普遍研究的热点。蛋白质组学技术已经广泛应用于癌症标记物的筛选中、药物靶标发现及临床疾病的早期诊断中。蛋白质组学技术，如高压液相色谱、二维电泳、表面增强激光电离质谱等，在生物学领域越来越多地发挥着重要作用。本实验应用二维电泳串联MALDI-TOF的方法，分析正常Hp菌与耐甲硝唑Hp菌的蛋白表达差异，从而为发现药物靶点提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验菌株 Hp 26695菌株（上海第二医科大学惠赠）。

1.2 实验仪器与试剂 质谱仪美国AB公司VOYAGER Biospeetromet；双向凝胶电泳仪器：安玛西亚有限公司；十二烷基磺酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)、三轻甲基胺基甲烷(TriS)、甘氨酸、漠酚蓝、乙二胺四乙酸均购自德国Merck公司；碘乙酞胺(IAM)、低熔点琼脂糖凝胶购自美国Sigma公司；甲酸、碳酸氢铵从美国Fisher公司购买；测序级胰酶、牛血清白蛋白(BSA)、蛋白酶抑制剂Roehe公司购买；线性IPG胶条购自GE Healtheare Amersham公司。其他化学试剂主要购于本地化学试剂公司。

1.3 试验方法

1.3.1 抗甲硝唑Hp诱导 将Hp 26695接种于琼脂平板，置于37℃微需氧环境中培养，接种于含不同浓度甲硝唑（1，2，4，8，16μg/mL）的液体培养基中，置于微需氧环境培养72h，观察Hp是否被抑制，选出耐药株。然后在不含甲硝唑的培养基中连续传3次，检测耐药性形成的稳定性。

1.3.2 样品制备 正常和耐药Hp分别培养于大约20个9cm×9cm平板，微需氧条件培养，收集细菌，7000g，离心30min，收集沉淀，提取总蛋白，通过2-DE技术分离，凝胶显色，得到蛋白质双向凝胶电泳图谱，利用Image Master软件进行图像分析，寻找敏感株与耐药株的差异性蛋白质斑点。以2倍或2倍以上变化的为差异点，共29个点进行质谱鉴定。

1.3.3 质谱检测 利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪进行差异点鉴定。通过分析软件分析得到的质谱结果。

1.3.4 数据库检索 UCSF数据库检索蛋白功能。

2 结果

2.1 敏感hp株与耐甲硝唑Hp株二维电泳结果见图1、2。

图1 敏感Hp二维电泳图

图2 耐药Hp二维电泳图

2.2 通过软件分析，差异点大于等于2倍的凝胶通过MALDI-TOF质谱鉴定，我们共发现27个差异蛋白质。耐药菌株与敏感菌株相比，8个蛋白表达下降，19个表达上升。功能涵盖：热休克蛋白、细胞呼吸链相关酶类、细胞壁及鞭毛合成的部分结构蛋白、金属离子转运蛋白和DNA突变蛋白等功能性蛋白质。主要蛋白的质谱信息，见表1。部分质谱检测结果见图3、4。

图3 蛋白UvrABC system protein A质谱鉴定图

图 4 蛋白Chaperone protein HtpG质谱鉴定图

表1 差异蛋白质谱检测结果

3 讨论

目前世界范围内根治Hp感染的方案主要是抗生素联合治疗。2种或3种抗生素共同作用可以有效根除Hp，但是目前临床的抗药性情况越来越严重，使医务工作者们不得不关注抗药性产生的各种相关因素。其中耐甲硝唑Hp的临床研究是主要研究方向。有研究发现Hp对甲硝唑的耐药机制与rdxA、frxA和fdxB基因突变相关，其中rdxA基因编码对氧不敏感的NADPH硝基还原酶，frxA编码NADPH flavin oxidoreductase，fdxB编码ferredoxin-like protein蛋白。

本研究中发现，耐药Hp菌株与敏感株比较，表达水平增高的蛋白主要的是Chaperone protein HtpG、（一种热休克蛋白）、UvrABC system protein A、Transcription-repaircoupling factor（UvrB family，破坏DNA 结构）、adenosine tRNA methylthiotransferase MiaB（离子转运）、Flagellar hook-associated protein 2（鞭毛形成），Protein translocase subunit SecA（ATP结合和金属离子转运蛋白）、NADP-specific glutamate dehydrogenase、Uracil-DNA glycosylase、MutS2 protein等，可以分析得出结论：耐甲硝唑Hp菌株应变外界变化，热休克蛋白增加；而抗生素的外界压力诱使细菌DNA突变和错配率升高；为了更好定植，鞭毛形成蛋白也起到锚定的作用，对抗外界环境变化；同时为了更好地适应外界抗生素环境，细菌需要更强的呼吸作用，所以一些和呼吸相关的酶类数量上升较为明显。

本研究中同时发现，耐药菌株与敏感株比较表达水平降低的蛋白质主要是Uncharacterized aminotransferase HP_0736、Elongation factor G、Protein translocase subunit SecA ATP、Translation initiation factor IF-2、Histidine-tRNA ligase、Molybdopterin synthase catalytic subunit等，主要的都是担任细菌分解作用的和代谢有关的酶类，可以推论细菌在适应外界抗生素环境时，分解和代谢能力下降，以适应外界不良环境。这些结果与一些文献[3-4]的研究有部分被提及，但本文发现的引起DNA错配和突变蛋白质如：MutS2 protein，及部分代谢类蛋白质尚无报道。有待进一步研究探索。

总之，研究本文相关功能蛋白质变化情况可以得出结论，敏感菌株和耐甲硝唑Hp中相关基因已经发生突变，其中呼吸链相关蛋白和金属转运蛋白，热休克蛋白可以进一步进行功能研究，从而筛选耐甲硝唑菌株差异的相关蛋白作为药物靶点[5]：例如DNA突变和错配的蛋白质MutS2 protein可以考虑作为抗药靶点，从而为科研及临床Hp治疗提供有力的理论依据和研究方向。

[1]郭刚，邹全明.幽门螺杆菌的基因组及蛋白质组学研究进展[J].世界华人消化杂志，2003，11(12)：2022-2026.

[2]Rizzato C,Kato I,Plummer M,et al.Risk of advanced gastric precancerous lesions in Helicobacter pylori infected subjects is influenced by ABO blood group and cagA status[J].Int J Cancer.2013 Jul 15;133(2):315-322.

[3]Jenks PJ,Edwards DI.Metronidazole resistance in Helicobacter pylori[J].Int J Antimicrob Agents,2002,19(1):1-7.

[4]刘琳娜，张静，丁士刚，等.胃癌高低发区胃癌与慢性胃炎患者幽门螺杆菌差异蛋白质的比较[J].北京大学学报：医学版，2011，43（6）：827-832.

[5]Tanih NF，Ndip LM，Ndip RN.Characterisation of the genes encoding resistance to metronidazole（rdxA and frxA）and clarithromycin (the 23S-rRNA genes) in South African isolates of Helicobacter pylori[J].Ann Trop Med Parasitol，2011，105(3)：251-259.