中缅树鼩三个多潜能基因cDNA片段的克隆和序列分析

王彩云，马云瀚，何大健，杨世华

1. 昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明 650500；

2. 昆明理工大学 医学院，云南 昆明 650500；

3. 中国科学院昆明动物研究所，云南 昆明 650223

树鼩 (tree shrews，Tupaia belangeri)被认为是最接近于灵长类的小型哺乳类动物，已被广泛应用于医学和生物学实验研究中 (Xu et al，2013)。诱导多能干细胞 (induced pluripotent stem cells, iPSc)是指转录因子Klf4、Sox2和c-Myc等促使体细胞重编程 (Takahashi & Yamanaka，2006; Takahashi et al，2007)，使其成为具有多潜能性的干细胞。因为iPS细胞能形成嵌合体动物而体现其全能性，掀起了人类再生医学研究的热潮。Sox2基因所编码的转录因子对于维持胚胎神经嵴干细胞多能性具有重要作用 (Laga et al，2010)。由Oct4和Sox2基因组成的调控复合物控制基因表达对于维持早期细胞发育非常重要 (Okumura-Nakanishi et al，2005)。C-Myc是一种原癌基因，失去该基因后细胞的重编程进度及效率均会显著降低 (Shi et al，2008)。Klf4能够连接Nanog的启动子区域并直接调控其表达，因此，在防止胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）的分化中起重要作用，同时，它也是维护细胞自我更新和保持多能性的重要基因 (Zhang et al，2010)。

小鼠及人类等的体细胞均可通过转录因子Klf4、Sox2、c-Myc及Oct4等诱导成为多能干细胞(Takahashi & Yamanaka，2006; Takahashi et al，2007)。但树鼩多潜能转录因子的核酸序列至今未见报道，影响了树鼩iPSc的研究，因此，本研究克隆并解析了树鼩的多潜能因子Klf4、Sox2和c-Myc等，为研究树鼩iPSc及基因转录分析提供了重要数据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

选取健康成体树鼩的骨髓和妊娠期～30 d孕体的不同组织器官 (肝脏、肠及大脑等)。

1.2 简并引物设计

通过 GenBank公布的人(NM004235；NM002467；NM003106)、猕猴(NM001142793；NM001142873；NM001142940)、牛(NM001105385；NM001046074；BC133458)及猪等(EU669075；FJ882404；EU503117)的Klf4、Sox2和c-Myc基因序列，用Primier 5.0软件设计简并引物 (Table 1)。

表1 Klf4、Sox2和c-Myc简并引物Table 1 Klf4,Sox2 and c - Myc degenerate primer

1.3 树鼩总RNA提取及简并PCR法扩增目的基因

使用RNA prep pure tissue kit (TIANGEN公司)提取树鼩组织总 RNA，提取方法按试剂盒说明书进行。

反转录反应实验按反转录试剂盒PrimeScript™ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara公司)说明书进行。PCR反应总体系为25 μL： DNA 2 μL，10× 缓冲液 2.5 μL，dNTPs 2 μL，上、下游引物各1 μL，easy TaqDNA聚合酶 (5 U/μL) 0.2 μL，ddH2O 16.3 μL。PCR 扩增程序：95 ℃预变性 5 min，95 ℃变性 45 s，58～60 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 50 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。

PCR产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳分离并纯化，再将Klf4、Sox2和c-Myc纯化产物与pMD18T载体连接，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。37℃转化株在提供X-gal/IPTG的LB培养基中孵育12 h。蓝白斑筛选阳性菌落，且每个基因挑取 5个不同的阳性菌落37 ℃摇床培养12 h，挑取菌斑用于基因测序。测序由上海生工测序公司完成。

1.4 序列分析

所得序列经校对后，进入GenBank数据库进行Blast分析，同时通过在线软件 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)对获得的树鼩 Klf4、Sox2和c-Myc的部分序列进行氨基酸推导。然后从GenBank中下载不同物种的Klf4、Sox2和c-Myc基因，利用 MEGALIGN对序列进行排列，并应用Mega5.0软件的邻接法(NJ)构建基因系统进化树。NJ分析采用Kimura two-parameter距离法，分支树可信度测试使用自展法 (Bootstrap)检验，经 1 000次重复抽样检验得到分支树节点的支持率。系统进化树构建所用序列见图4、图5和图6。

2 结果

2.1 树鼩总RNA的获取

树鼩总 RNA采用琼脂糖凝胶电泳法验证质量(图 1)，所选取的两个样品的 rRNA 三条带清晰，表明提取的 RNA具有良好的完整性，并适用于后续实验。

图1 树鼩组织总RNAFigure 1 Total RNA extracted from tissues of tree shrews

2.2 目的片段的检测

RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳显示，目标条带与预期目的基因大小一致(图2)。

图2 树鼩Klf4、Sox2和c-Myc的RT-PCR扩增结果Figure 2 Amplification results of Klf4, Sox2, and c-Myc genes by RT-PCR

2.3 树鼩Klf4、Sox2和c-Myc基因部分片段的序列分析

获得的 Sox2、c-Myc 和 Klf4部分序列长度[GenBank登录号分别为Klf4 (K1 KC480548)、Sox2(S1 KC480549) 和 c-Myc (C1 KC480547)]与预期结果一致，分别为612、485 和382 bp (测序结果及推导的氨基酸序列见图3)。树鼩Klf4部分序列与人 (Homo sapiens)、猕猴 (Macaca mulatta)、牛 (Bos taurus)、猪 (Sus scrofa)以及鼠 (Mus musculus) 等相应序列的相似性分别为 89%、90%、90%、89%和86%，编码127个氨基酸；Sox2部分序列与人、猕猴、牛、猪及鼠等相应序列的相似性分别为98%、97%、96%、97%和95%，编码204个氨基酸，且该氨基酸序列与猕猴的 Sox2氨基酸序列仅存在 1个氨基酸的差别，相似性高达99%；c-Myc部分序列与人、猕猴、牛、猪及鼠等相应序列的相似性分别为89%、89%、90%、92%和87%，编码161个氨基酸。

图3 树鼩Klf4、Sox2和c-Myc基因部分序列及推导的氨基酸序列Figure 3 Partial nucleotide and predicted amino acid sequences of Klf4, Sox2, and c-Myc genes in tree shrews

2.4 树鼩Klf4、Sox2和c-Myc基因部分片段的进化分析

在基于 Klf4部分序列以及推导氨基酸序列构建的系统树中 (图4)，各分支具有较高的置信度，说明这些动物之间的系统进化关系具有较高可信度。由系统树可见，人 (Homo sapiens)、黑猩猩 (Pan troglodytes)和猕猴 (Macaca mulatta)等聚为一类(灵长类)；牛 (Bos taurus)、羊 (Ovis aries)和猪 (Sus scrofa)等聚为一类 (偶蹄类)；小家鼠(Mus_musculus)和褐家鼠 (Rattus norvegicus)等聚为一类(啮齿类)。其中树鼩以较高的支持率与灵长类聚为一支。同样，在基于Sox2部分序列构建的系统树中 (图5)，各类动物聚类情况与Klf4类似，树鼩同样与灵长类聚为一支，但支持率有所降低。由于不同类群动物的 Sox2基因推导的氨基酸同源性非常高，系统分析时各分支支持率很低 (结果未给出)，因而未给出其氨基酸序列构建的系统树。在以c-Myc部分序列以及推导氨基酸序列构建的系统树中 (图6)，灵长类、偶蹄类和啮齿类等虽各聚为一支，但树鼩以较高的支持率与偶蹄类动物聚为一支。

图4 基于Klf4基因部分序列以及推导氨基酸序列构建的系统进化树Figure 4 Phylogenetic tree of nucleotide sequences (a) and deduced amino acid sequences (b) of the Klf4 gene

图5 基于Sox2基因部分序列构建的系统进化树Figure 5 Phylogenetic tree based on partial nucleotide of the Sox2 gene

图6 基于c-Myc基因部分序列以及推导氨基酸序列构建的系统进化树Figure 6 Phylogenetic tree of nucleotide sequences (a) and deduced amino acid sequences (b) of the c-Myc gene

3 讨论

树鼩的分类学及生物学特征研究较为广泛，已证明其许多生物学特性可以作为人类疾病模型的重要材料 (Xu et al，2013；Ping et al，2012；Zhang et al，2012)。本研究结果为进一步探索树鼩的生殖工程和疾病模型提供了重要数据。

人(Homo sapiens)的Klf4、Sox2和c-Myc全长分别为2 949、2 520和2 379 bp，本研究获得的Klf4、Sox2和c-Myc部分序列长度分别为382、612和485 bp，分别对应于人相应基因的 675～1 060 bp、729～1340 bp 和 1 082～1 566 bp。基于 Klf4、Sox2 和c-Myc部分序列的进化分析支持偶蹄动物与灵长动物的亲缘关系，较与啮齿动物的亲缘关系更为接近，与动物种系进化关系相一致。在基于 Klf4和Sox2部分序列构建的基因树中，树鼩与灵长类动物的亲缘关系更近，而与偶蹄动物和啮齿动物的亲缘关系较远。但在c-Myc基因系统进化树中，树鼩与偶蹄动物的亲缘关系更近。这说明 Klf4、Sox2与c-Myc基因可能在进化方式或速度上存在一定的差异。另外，由于本研究中暂未获得这几个基因的全长序列而仅克隆了较为保守的部分序列，利用部分序列进行进化分析，可能不能很准确反应这些类群的真实亲缘关系。

由于目前 GenBank数据库中尚未收录树鼩的Klf4和Sox2基因序列，在一定程度上限制了树鼩的分子生物学研究。本研究采用简并 PCR扩增，成功克隆了树鼩Klf4、Sox2和c-Myc基因cDNA的部分序列，为克隆这三种基因的全长提供了良好基础。

另外，以往的研究认为iPS在小鼠疾病模型及胚胎干细胞研究中具有相似的功能 (Hanna et al，2007)。因此，我们假设可以通过导入树鼩的3种基因Sox2、c-Myc和Klf4来诱导树鼩多潜能干细胞。推测该模型的评估治疗效果较小鼠模型将更加可行。目前关于树鼩的这3个基因功能的研究还未见报道，本研究首次对树鼩Klf4、Sox2和c-Myc三个基因cDNA部分片段进行了克隆和序列分析，旨在为进一步研究诱导树鼩多潜能干细胞奠定基础。

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