不同诱导阶段的骨髓间充质干细胞修复兔骨损伤的实验研究

朱莎 凌斌 孙洁

因创伤或疾病造成的骨损伤极为常见。近年来，骨髓间充质干细胞 （Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）的临床应用已成为研究的热点[1-5]。BMSCs在不同诱导剂的作用下，定向分化为各种组织的成体细胞前，都可能阶段性地处于对应的前体细胞或前体干细胞的状态，亦或是各种“专能干细胞”的状态。而目前国内尚无BMSCs诱导分化不同阶段细胞移植治疗组织损伤修复的疗效评价和报道。本实验将BMSCs诱导分化不同阶段的细胞移植入骨损伤动物模型，比较不同分化阶段的细胞对组织损伤修复的疗效，确定最适宜移植的细胞时间和状态，从而最大程度发挥BMSCs在组织损伤修复中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料试剂和仪器

H-DMEM培养基、标准胎牛血清（Gibco公司，美国），CD34、CD45 、CD73、CD105 抗体、 慢病毒包装质粒和表达质粒：Vivid color TM pLenti6.2-GW/EmGFP Expression Control Vector及ViraPowerTM Lentivirus Expression System（Invitrogen公司，美国），苏木精、伊红（上海美季生物技术有限公司），胰蛋白酶、二甲基亚砜、4%多聚甲醛（Sigma公司，美国），碱性磷酸酶染液（南京建成科技有限公司）。

SW-CJ-2F百级层流超净工作台 （苏州佳宝净化工程设备有限公司），Heal Force HF240细胞培养箱（上海力申科学仪器有限公司），倒置相差显微镜（Nikon公司，日本），全自动脱水机、组织包埋机HISOCENTREZ（Shandon 公司，英国），流式细胞仪（BD Calibur公司，美国），激光共聚焦显微镜（LSM500，德国），外科手术器械（中国科学院昆明动物研究所提供）。

正常健康新西兰大耳白兔40只，雌雄不限，体质量2.5～3.0 Kg，由中国科学院昆明动物研究所实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合2006年科技部 《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。

1.2 方法

1.2.1 兔尺骨骨折模型的制备

参考前期兔开放型骨折模型制备方法[6-8]，大耳白兔电子秤上秤重，10%水合氯醛3.5 mL/Kg腹腔注射麻醉，固定于手术台。兔仰卧位，左上肢备皮。于左前肢中段掌外侧作纵形切口，切开皮肤及皮下组织，暴露尺骨中段，环形切开相应长骨膜，不锈钢锯条沿两端点锯断尺骨，形成5 mm长的缺口，注意使两断端平面尽量保持平行且避免过度倾斜。青霉素冲洗，切口逐层缝合包扎，不行任何固定。术后每日肌注青霉素400 000 U/只，连续3 d。造模后立即在麻醉下拍摄患肢正位X线片，了解骨折类型及移位程度，要求骨折类型为横断型，无明显移位。

1.2.2 BMSCs的分离、培养及鉴定

2%利多卡因2 mL局部浸润麻醉大耳白兔，股骨髓腔内抽取骨髓约3～4 mL，加入40 mL PBS稀释，2 000 r/min离心3 min，弃上清，重复3遍。重悬细胞，加入3.5 mL红细胞裂解液，冰板上持续摇晃30 min，破碎红细胞，待红细胞充分裂解后加入PBS至10 mL，3 000 r/min离心3 min，弃上清，再洗涤3遍。细胞用培养液重悬，移入含10%FBS的DMEM完全培养液的5 mL培养皿中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。24 h后换液，弃掉悬浮的单个核细胞及培养液，在倒置相差显微镜下观察细胞形态，每隔3～4 d换液，按1∶2传代。应用流式细胞仪对培养至第 3 代的细胞表面抗原 CD34、CD45、CD73（SH3）、CD105（SH2）进行表型鉴定。

1.2.3 细胞的转基因标记

采用脂质体介导转染法，将含绿色荧光蛋白的慢病毒转染兔骨髓间充质干细胞，以ViraPowerTM Lentivirus Expression System制备慢病毒。将质粒用LipofectamineTM2000转导入汇合度80%的293FT细胞中，转导后12 h换新鲜培养基，换液后48～72 h收集培养基，用0.45 μm的滤膜过滤培养基，超速离心机25 000 r/min，4℃离心3 h，100倍浓缩病毒。在无抗生素条件下，将病毒添加到培养基中，和BMSCs共培养8 h后，换新鲜培养基。

1.2.4 BMSCs向前体骨细胞的定向诱导

用传至第3代的BMSCs计数后接种于6孔板中。次日半量换液，改成含有地塞米松0.1 μmol/L、维生素 C 50 μmol/L、β-甘油磷酸钠 10 μmol/L 及含10%FBS的H-DMEM的成骨诱导培养液。以后每2～3天换液，镜下观察细胞形态变化。

1.2.5 不同分化阶段的细胞移植

胰酶消化各阶段细胞，制备成1×106cells/mL的2 mL细胞悬液，按照3×106cells/Kg注射兔骨损伤模型，注射速度为1 mL/min；对照组注入等量HDMEM培养基，并观察移植后组织绿色荧光表达。

1.2.6 移植后X线片观察

分别于移植后第2、4、6周时，摄X线片，读片采用盲法，评价两项参数。根据骨折愈合过程中外骨痂和骨折线的变化规律，将外骨痂和骨折线进行半定量检测[9]。

外骨痂定量：0分，外骨膜无反应；1分，外骨膜出现反应；2分，外骨痂大小或密度较前明显提高；3分，外骨痂连在一起形成皮质骨桥；4分，外骨痂轻度吸收；5分，外骨痂明显吸收；6分，外骨痂接近完全吸收，骨折处皮质骨密度接近正常皮质骨。

骨折线定量：0分，骨折线清晰无变化；2分，骨折线开始变为模糊；4分，骨折线模糊未消失，但出现较牢固的连接迹象；6分，骨折线己消失，骨折线被高密度的骨痂取代；8分，骨髓腔处密度开始减低；10分，骨髓腔处密度减低明显；12分，骨髓腔完全再通。

将评分相加即为骨折愈合的X线评分。

1.3 统计学处理

使用SPSS 11.5进行统计学处理。全部数据采用均数±标准差表示，各实验组的组间及组内比较均采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异显著。

2 结果

2.1 体外培养兔BMSCs的形态

光镜观察发现，接种24 h可见部分细胞贴壁；培养36～48 h后，贴壁的单核细胞开始增多；5～7 d后，逐渐形成分散的细胞集落，集落之间彼此相连，细胞紧密排列，呈旋涡状、网状、放射状向周围扩展，逐渐与邻近集落相融合；12～14 d，细胞各个集落间相互融合达85%，细胞相互间紧密贴附，单个细胞呈狭长梭形，大多数细胞沿胞体长轴呈有序排列；经3～4次传代后，形成较典型的BMSCs（图1）。

2.2 兔BMSCs表面抗原的流式细胞分析

结果显示，体外培养的BMSCs不表达血细胞表面标记，如CD34、CD45；表达间充质干细胞表面标记 CD73、CD105（图 2）。

2.3 兔BMSCs的GFP标记

激光共聚焦显微镜观察显示，慢病毒转染后培育48 h，GFP标记的BMSCs显示绿色荧光（图3）。

2.4 BMSCs诱导为成骨细胞的细胞形态变化

BMSCs诱导3 d后，细胞增殖旺盛，呈漩涡状生长，融合成单层，细胞形态仍保持长梭形。诱导7 d时，细胞增殖速度减慢，开始出现细胞聚集的现象，细胞逐渐汇合呈铺路石状，细胞形态发生改变，由梭形变为胞体较小的立方形，高倍镜下可见细胞呈复层生长。诱导8～10 d时，细胞呈多角形成骨样细胞，胞质颜色变深，含粗大颗粒，胞核明显，胞外基质分泌逐渐增多，胶原堆积，钙盐沉积。诱导14 d时，形成不透光、散在褐色点状矿化结节中心。诱导21 d时，矿化结节连接成小片状（图4）。诱导28 d时，细胞开始从培养皿壁脱落，见大量悬浮死细胞。

2.5 受体组织荧光表达检测

移植后荧光显微镜观察显示骨组织内有移植细胞存在，可见散发绿色荧光（图5）。

2.6 不同阶段细胞移植后的疗效评价

未诱导组同诱导7 d和21 d组造模后第6周时骨髓腔仍未通。3 d组在细胞移植后第2周时外骨痂量较多，骨折间隙处密度开始增高，部分骨折线呈现较牢固连接迹象；第4周时外骨痂开始吸收，骨折线消失，被高密度的骨痂取代；第6周时外骨痂接近完全吸收，骨折处皮质骨密度接近正常皮质骨，骨髓腔完全再通。诱导7 d组和21 d组细胞移植后第2周时骨折线模糊，出现少量外骨痂，骨折线尚未出现牢固连接迹象；第4周时大量的外骨痂，骨折线出现牢固连接迹象，但外骨痂无吸收；至造模后第6周骨折线消失，外骨痂开始吸收，骨髓腔仍未通。对照组中有出现断端硬化不愈合现象。

BMSCs未诱导组、诱导7 d和21 d组无明显差异（P>0.05），且均显著高于对照组（P<0.01），3 d 组评分高于7 d和21 d组（P<0.05），且显著高于对照组（P<0.01）（表1）。

图1 第三代 BMSCs（100×）Fig.1 BMSCs of passage 3(100×)

图2 流式细胞仪检测BMSCs表面抗原Fig.2 Surface antigen of BMSCs detected by FCM

图3 GFP标记的BMSCs（100×）Fig.3 GFP labeled BMSCs(100×)

图4 BMSCs诱导21 d（100×）Fig.4 BMSCs after induced for 21 days(100×)

图5 移植后骨组织切片免疫荧光检测（20×）Fig.5 Immunofluorescence detection of bone tissue after transplantation(20×)

3 讨论

骨折愈合是一个缓慢而复杂的过程，存在许多影响愈合的因素。骨折的传统治疗方法存在一定局限性，如治疗周期长、操作复杂、医药费用高、不良反应多等。近年来，随着BMSCs研究的不断深入，BMSCs的移植治疗已有望应用于临床。

研究显示，多种因素的综合影响诱导了相关发育基因在序列上的改变，促使干细胞向不同组织细胞分化[10-13]，并且有的研究认为诱导的细胞更优于干细胞本身[14-15]。在诱导剂的作用下，BMSCs来源的前体细胞或前体干细胞的功能在整个被诱导过程中并不是一成不变的。因此，把不同功能状态的细胞进行体内移植后可能会产生不同的效果。本实验将诱导分化不同阶段的BMSCs移植入骨损伤动物模型，比较不同阶段的“前体干细胞”应用于骨损伤修复时产生的效果差异，从而最大程度发挥BMSCs在组织损伤修复中的作用。

X线片显示的骨折线模糊程度，基本反应了骨痂变化，外骨痂评分说明骨外膜形成和塑形情况。X线评分近似地反映骨折愈合过程的各个阶段变化，从而有利于比较各组骨折愈合程度。通过移植细胞后2、4、6周的X线观察及分析，未诱导组和诱导7 d和21 d组比较无明显差异，3 d组治愈程度明显优于对照组，且优于未诱导组和7、21 d组。从而证明了成骨诱导3 d较BMSCs和成体细胞更能加速骨痂形成与钙化，加快骨塑形，提高骨折愈合速度。证明了BMSCs和BMSCs诱导分化的前体骨细胞在骨损伤治疗上都发挥了作用，但BMSCs成骨诱导3 d组疗效更为显著，很有可能是最适宜移植的。

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