雌性乳鼠颅骨来源的成骨细胞培养方法的建立及其评价

那 键，马 超，霍维玲，秦瑞云，许 永，王 涛，吴晓东，谷贵山

（1.江苏省徐州市中心医院骨关节科，江苏 徐州 221009；2.吉林大学第一医院骨关节科，吉林 长春 130021）

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级雌性Wistar大鼠乳鼠40只

（出生48h以内），吉林大学动物实验中心提供。

1.2 主要试剂与仪器 茜素红（北京中山生物技术公司），台式高速离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司），倒置相差显微镜（NIKON公司），ELISA酶标仪（美国ELx800），β－甘油磷酸钠、地塞米松和维生素C（美国Sigma公司），碱性磷酸酶免疫组织化学试剂盒（南京建成生物制品有限公司），Ⅱ型胶原酶和胎牛血清（北京鼎国生物技术公司），高糖DMEM培养基（美国Gibco公司）

1.3 颅骨来源成骨细胞分离 将大鼠乳鼠拉颈处死，75%乙醇中浸泡10min，在超净工作台中无菌条件下平皿内取出颅骨，仔细剔除表面附着软组织，剔除骨缝之间软骨，用PBS浸泡冲洗3次，至骨块发白透亮，用眼科剪刀将其剪成1mm×1mm×1mm左右碎块。再加入10倍体积的0.25%胰蛋白酶，37℃水浴箱内置20min，每10min摇晃1次以消化掉纤维组织、成纤维细胞和血细胞，共2次，去除悬液，因为悬液里含有大量消化下来的成纤维细胞。然后再加入2倍体积的Ⅱ型胶原酶消化。在37℃水浴箱中1h，过200目筛网去除碎骨块，细胞悬液以1 000r·min－1离心5min，收集消化液中的细胞，PBS漂洗后接种于25cm2培养瓶，加入10%胎牛血清DMEM培养液，放置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养。胶原酶消化及提取细胞步骤重复4次。2～3d换液待细胞近铺满全瓶后传代。

1.4 细胞的传代培养 ①细胞融合后弃培养液，用PBS清洗3次；②用0.25%胰蛋白酶（含0.01%EDTA）1mL消化细胞，置细胞培养箱中消化2min，显微镜下观察，当细胞变圆、细胞间隙增大时，轻轻振动培养板使细胞脱壁，加入10%胎牛血清终止消化；③用吸管吸取瓶中培养基按一定顺序冲洗瓶壁，使全部细胞脱壁形成单细胞悬液，将细胞悬液移入离心管20℃、1 200g离心10min；④弃上清液，加1mL培养基用吸管反复吹打瓶壁，重悬细胞，血细胞计数板计数并调整细胞浓度为2×105mL－1，取0.1mL细胞悬液移入50mL培养瓶中，37℃、5%CO2湿化空气的孵箱中进行静置培养。此为第1代成骨细胞。传代过程中每2～3d换液1次，直到细胞彼此汇合铺满整个培养瓶底，然后按1∶2的量接种培养，为第2代大鼠成骨细胞，依此类推。

1.5 体外培养成骨细胞纯化 采用差速黏附的方法来纯化细胞：利用成纤维细胞比成骨细胞更易黏附到瓶壁的特点将消化下来含成纤维细胞的悬液接种到培养瓶中，静置20min左右，轻轻吸取上清液到另一培养瓶中，20min后再将培养液吸出接种于第3个培养瓶中，形成的细胞悬液中即为纯化的成骨细胞。每次传代时均用此法纯化成骨细胞。

1.6 大鼠颅骨来源成骨细胞鉴定 ①生长情况和形态学观察：每天观察培养的原代及传代大鼠成骨细胞测定其生长情况（MTT法），绘制细胞生长曲线，同时用倒置相差显微镜观察其形态学的变化。传代细胞以1×104接种于96孔板，每孔加入常规成骨细胞培养液180μL，每组设8个重复孔。每天检测时间点前4h加 MTT（5g·L－1），20μL/孔，检测时加DMSO，150μL/孔，酶标仪检测吸光度（A）值（波长为490nm）。绘制细胞生长曲线。②苏木精染色观察：取第3代培养的成骨细胞进行苏木精染色，用PBS洗3次；4%多聚甲醛固定10min，双蒸水冲洗；加苏木精染液5min，盐酸酒精分色，流动自来水冲洗3min，蓝化、双蒸水浸洗5min，酒精脱水，二甲苯透明，树胶封固。③碱性磷酸酶（ALP）染色（改良Kaplow氏法）：成骨细胞可以特异性形成ALP，成骨细胞融合成层后，胞质内含有丰富的ALP，通过ALP染色可以对细胞进行鉴定。本实验采用改良Kaplow法染色对所诱导的成骨细胞形成ALP能力进行测定。将第3代细胞接种于有钙玻片的培养皿中，待细胞长至形成结节后取出，PBS冲洗，甲醛固定液固定10min，蒸馏水冲洗数次晾干，滴加新鲜配制的底物液盖满样本部分加封口膜，37℃孵育液中15min（现用现配），蒸馏水冲洗数次，用苏木素复染3min，蒸馏水洗数次晾干。④矿化结节的茜素红染色：该染色法是鉴别成骨细胞的特异性染色法。连续培养25d的细胞爬片，PBS洗3次，95%乙醇固定10min，水洗后，用饱和茜素红染色30min，水洗，乙醇脱色，二甲苯透明，树胶封片后观察。

2 结 果

2.1 细胞的一般形态学观察 刚分离的原代细胞贴壁前是均匀一致的小球形，折光性强，大小不一，细胞周围有光晕，细胞核偏于一侧，可见清晰的核仁。接种24h后可见部分圆形细胞以散在的方式贴壁，贴壁细胞有小的突起，随着培养时间延长，细胞伸出较多突起，有的突起相互连接。48～72h细胞完全贴壁伸展成饱满多角状，成多个集落。7～8d时集落迅速增多。至10～15d细胞约进入快速生长期，集落中心细胞密集，周围细胞呈放射状或旋涡状排列，细胞之间无接触抑制现象，集落间出现重叠，各集落的大小、细胞的疏密程度和细胞排列方式不尽相同。15～20d细胞融合，细胞重叠复层生长。传代培养的成骨细胞其形态呈现出不规则多角形，多为不规则三角形或四边形，细胞表面有短而薄的突起。苏木精染色显示：细胞形态不规则，表面有长的突起，细胞之间连接成网状，细胞核椭圆形，核仁1～2个（图1，见封三）。

2.2 成骨细胞成骨特性的鉴定 ①ALP染色：经ALP染色后，细胞浆为紫黑色，并可见大量紫黑色颗粒。约80%以上的细胞呈阳性（图2A，见封三）。②矿化结节染色：经矿化结节染色后，可见胞外基质中的红色矿化结节（图2B，见封三）。

2.3 MTT法测定细胞的增殖结果 第3代细胞生长曲线呈现标准的 “S”型，有明显的对数生长期及平台期，符合成骨细胞生长规律（图3）。

图3 大鼠颅骨来源第3代成骨细胞生长曲线Fig.3 The growth curve of osteoblasts at the 3rd generation from rat skull

3 讨 论

成骨细胞在体内能合成和分泌胶原、糖蛋白等类骨质成分，参与类骨质的钙化过程，是体内参与骨形成过程的主要细胞[1]，是体外成骨细胞实验的主要细胞来源。1974年Birlderraan详述了成骨细胞分离、培养和初步鉴定方法，此后体外成骨细胞原代培养方法逐渐发展成型[2]。

目前从骨组织获取成骨细胞的方法主要有酶消化法和组织块培养法，酶消化法是将骨组织块经酶消化处理后收集细胞进行培养，一次可获较多量细胞，是目前较常用方法。有研究证实：骨组织中各种细胞耐受消化酶能力依次为：成纤维细胞＜破骨细胞＜骨祖细胞＜成骨细胞。分步酶消化法可将首次消化获得的细胞抛弃，以减少首先消化下来的成纤维细胞、破骨细胞、骨祖细胞等的污染，再行消化可收集到较纯的成骨细胞。常用的消化酶主要有胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶。由于成骨细胞比较脆弱，故培养难度较大，如何获得大量优质的原代来源成骨细胞是一个有挑战性的难题。本实验对酶消化法进行改良取得了理想的效果。

本研究中组织来源为出生24～48h内雌性大鼠乳鼠颅骨，优点是成骨细胞较多，细胞活力强，且骨组织易于处理。取颅骨时应注意剔除骨膜及周围透明软骨结节，以减少杂质细胞的污染。为了保证成骨细胞活性，所有操作过程应在冰盒上进行。

传统的胰蛋白酶消化处理时间为1h甚至更长，Ⅱ型胶原酶过夜消化，实践证明这种方法容易损伤细胞膜表面受体和抗原成分，细胞成活率低或者细胞功能受损。鉴于此，本实验对消化的时间及方法进行了改良，视骨组织块大小灵活掌握消化时间，尽量将胰酶作用时间控制在30min以内，如果切成乳糜状，胰蛋白酶消化时间应该小于20min，消化1次即可去除杂质细胞，过长时间的消化导致骨组织上的需要的成骨细胞数量过少且功能受损，二次胶原酶消化后成骨细胞成活率很低往往导致失败。如果骨块在1mm×1mm×1mm左右，则胰蛋白酶可以每次消化25～30min，连续消化2次，以彻底消化去除非目的细胞。有报道称Ⅱ型胶原酶对细胞无明显影响，故本实验初期做胶原酶过夜消化，结果细胞数量很多，但成活率很低，很多细胞无法贴壁。本实验采取的办法是Ⅱ型胶原酶消化1h，每隔1h收集1次细胞，更换胶原酶继续消化1h，获得大量优质种子细胞。

获取的原代细胞最好采用一次性的塑料培养瓶，因其带有负电荷细胞容易贴壁生长。使用前要预加入培养液培养1h。细胞接种后可采用差速贴壁法提纯成骨细胞。因为成纤维细胞先贴壁，所以传代后静置20min时成纤维细胞已经贴壁，将仍未贴壁的成骨细胞接种至另一培养瓶。另外每次换液时要轻轻摇晃培养液以倒掉非贴壁的杂质细胞。

成骨细胞体外生长大致经过快速增殖、细胞外基质形成和基质矿化3个生长阶段。本研究结果证实：体外培养大鼠颅骨成骨细胞培养约6～7d后细胞完全贴壁进入快速增殖期；当细胞生长至单层融合状态时分裂速度减慢，不传代细胞成集落分层生长，Ⅰ型胶原等骨基质成分分泌活跃，3～5周时终基质钙化结节形成。Sudo等[3]报道：体外培养条件下成骨细胞可产生特异性钙化，这是鉴定成骨细胞的重要依据，体外培养的成骨细胞在有维生素C和β－甘油磷酸钠的DMEM培养液内生长时，促进了钙盐沉积[4]，有利于矿化结节形成。

对于成骨细胞分化成熟的调节是目前国内外研究的热点，已经明确的因素包括骨形态发生蛋白（BMP）[5]、细胞生长因子、激素和机械物理等。最新研究[6－7]表明：微孔钛丝可以诱导成骨细胞分化及成熟，Wnt5a蛋白可以增加BMP2、BMP4和BMP7表达，进而促进成骨细胞分化及成熟，氨基丁酸可以通过下调BMP2及RANKL表达诱导成骨细胞向破骨细胞分化而减少成骨细胞分化及成熟[8]。钙离子和硅酸根离子[9]、13－93玻璃纤维[10]及聚磷腈[11]在体内外对成骨细胞分化成熟均可起正向调控作用。

本实验可获得纯度较高的体外培养成骨细胞，并且具有典型成骨细胞的生物学特征，本研究为体外原代培养成骨细胞提供一种合理、有效的方法。

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