大肠杆菌O157∶H7异硫氰酸荧光素标记抗体的制备及评价

方 珍，鞠 文，秦亚楠，孟日增，3，潘风光

（1.吉林大学军需科技学院食品质量与安全教研室，吉林 长春 130062；2.吉林大学公共卫生学院卫生检验教研室，吉林 长春 130021；3.吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心，吉林 长春 130062）

O

157∶H7是大肠杆菌中重要血清型，其感染剂量极低，一次摄入10个活菌就可致病[1]。因此，做好食品中E.coliO157∶H7的检测具有重要的意义。微生物检测方法很多，包括细菌培养法、聚合酶链式反应（PCR）法及酶联免疫吸附法等，但均 有 不 足 之 处[2－5]。 免 疫 荧 光 技 术（immunof1uorescence technique）是用荧光素标记的抗体检测抗原或抗体的免疫学标记技术，又称荧光抗体技术。所用的荧光素标记抗体通称为荧光抗体，系由荧光素 （常用异硫氰基荧光素，fluorecein isothiocyante，FITC），以化学方法与效价较高、活性较强的抗体共价结合后制备而成[6]。国内外关于FITC标记蛋白应用于免疫荧光检测早有报道，但对于E.coliO157∶H7免疫荧光检测的研究尚未见报道。进行免疫荧光检测的关键在于制备纯度高、效价高、特异性好、稳定性好的荧光素标记抗体，完成抗体的前期准备，对于E.coliO157∶H7免疫荧光检测方法的建立具有重要作用。本实验旨在制备高效价高纯度的E.coliO157∶H7多克隆抗体，通过优化FITC标记抗体的条件，制得能广泛适用于E.coliO157∶H7免疫荧光检测的FITC标记多克隆抗体。

1 材料与方法

1.1 实验动物、菌株及试剂 新西兰大耳兔7只，体质量约2.5kg，购自长春市生物制品所。大肠杆菌O157∶H7标准菌株由吉林出入境检验检疫技术中心微生物实验室保存。FITC（美国Sigma公司），SDS-PAGE试剂盒、BCA蛋白含量测定试剂盒（康为世纪公司），HiTrap Protein G纯化柱（美国GE公司）。

1.2E.coli多克隆抗体的制备 ①抗原的制备：标准大肠杆菌O157∶H7菌株于LB培养基增菌培养8h，离心弃培养基，生理盐水洗3次，计数。甲醛灭活后超声破碎1h。② 抗血清制备：按传统方法制备疫苗，取菌量为2×108cfu的疫苗对家兔进行背部多点免疫4次。颈动脉无菌采血，分离免疫血清，间接ELISA法测定效价[7－8]。

1.3 抗体的纯化 采用辛酸－饱和硫酸铵法粗提抗体IgG[9－10]，所 得 蛋 白 经 0.22μm 过 滤，采 用HiTrap Protein G蛋白纯化系统进行进一步纯化，通过按5%梯度增加蛋白洗脱液的方法确定最佳洗脱方法。纯化效果通过聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳法（SDS-PAGE）进行验证。采用BCA蛋白测定试剂盒测定抗体蛋白浓度。

1.4 FITC标记多克隆抗体的制备 取抗体蛋白总量为1mg适量体积溶液，用pH 9.0的碳酸盐缓冲液对抗体溶液进行透析，使蛋白处于碱性环境。根据文献报道选择标记条件[11－12]。①确定最佳反应比值：按照FITC与蛋白含量比值分别为1∶20、1∶10、3∶20计算FITC用量，逐滴加入溶于二甲基亚砜的FITC，室温避光反应4h，进行FITC标记。②确定最佳标记抗体反应条件：由所得到的最佳比值计算FITC用量，按照反应条件为4℃、2h，20℃、4h，37℃、30min，进行FITC标记。反应后液体用超滤离心管6 000r·min－1离心20min，反复多次，收集每次离出液，测定荧光值（F485/535），直至离出液无荧光值。测定标记后F485/535值，结合显著性差异分析及实际情况，得到最佳FITC与抗体含量比值和反应条件。

1.5 荧光标记抗体与混合菌液反应 取E.coliO157∶H7活菌液100μL与S.aureus混匀，滴至载玻片上，火焰固定30s自然风干后分别滴加10倍比稀释的FITC标记多克隆抗体50μL，滴加伊文氏兰染液覆盖染色15min，蒸馏水洗涤干净后于荧光显微镜下观察荧光抗体与菌液反应的结果。

1.6 统计学分析 采用SPSS 10.0软件进行统计学处理，F485/535以±s表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 血清效价测定结果 4次免疫后效价见图1。第2、3、4号兔血清1∶25 600稀释时，A450≥2.1倍阴性对照值，故选择2、3、4号兔进行纯化制备多克隆抗体。

图1 每次免疫后兔血清效价结果Fig.1 The antibody titers of rabbit serum after every immunization

2.2 多克隆抗体的纯化结果 经辛酸－饱和硫酸铵法粗提的血清由5%梯度洗脱，结果见图2。收集100%洗脱液洗脱蛋白，即第3峰值所得蛋白由超滤离心管浓缩，SDS-PAGE结果见图3，经35%、100%梯度洗脱所得抗体蛋白条带出现在55 000与20 000处，与文献[13]相符，说明所得为多克隆抗体IgG。浓缩后抗体蛋白含量由BCA试剂盒测定结果为23.6g·L－1。

2.3 多克隆抗体特异性检测 应用间接ELISA法测定多克隆抗体特异性，以未免疫健康兔血清为阴性对照。所制多克隆抗体与9种肠杆菌反应测得A450（测定值－PBS对照孔值）分别为：沙门氏菌0.095，阴沟肠杆菌0.084，克雷伯杆菌0.091，粪肠球菌0.084，坂崎肠杆菌0.103，黏质沙雷杆菌0.071，奇异变形杆菌 0.079，单增李斯特菌0.104，E.coliO157∶H7 1.2，阴性 血清对照0.069。所制得多克隆抗体与大肠杆菌O157∶H7外其他8种肠杆菌无交叉反应，特异性良好。

图2 不同浓度洗脱液进行HiTrap Protein G纯化多克隆抗体结果Fig.2 The results of purified polyclonal antibody under the different doses of elution conditions

图3 不同条件纯化蛋白SDS-PAGE结果Fig.3 The SDS-PAGE results of purified protein under different conditions

2.4 多克隆抗体FITC标记结果 应用不同FITC∶抗体蛋白含量对抗体进行标记，测定5次所得标记抗体的 F485/535分别是：1∶20为58 207.00±8.27，1∶10 为 71 368.00±2.38，3∶20为78 231.00±8.63。在不同反应时间与反应温度条件下测定5次所得标记抗体的F485/535值分别是：4℃、2h为70 912.00±6. 41；20℃、4h为70 781.00±8. 30；37℃、30min为71 094.00±3.65。对3组不同FITC∶抗体蛋白含量比值条件进行标记所得F485/535进行两两比较，FITC∶蛋白含量为1∶10与1∶20所得标记产物F485/535值比较差异有统计学意义（P＜0.05），FITC∶蛋白含量为1∶10与3∶20所得标记产物F485/535值比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.5 荧光标记抗体反应观察结果 荧光显微镜下观察荧光标记抗体与混合菌液反应的结果见图4。无荧光照射下混合菌液，菌体由于伊文氏兰染色显示红色（图4A，封三）。1∶1 000倍稀释荧光抗体与菌液反应，在中度荧光强度照射下15min时，由于S.aureus无荧光标记，无法在视野下观察到（图4B，见封三）。

图4 显微镜下抗体与E.coli O157∶H7和S.aureus混合液反应观察结果Fig.4 The observation results of the reaction of antibody with mixed liquid of E.coli O157∶H7and S.aureus under microscope

3 讨 论

本实验在应用HiTrap Protein G进行抗体纯化过程中创新性地采用了梯度增加洗脱液的方法，血清在由35%洗脱液冲洗条件下即可出现峰值，且由间接ELISA验证与抗原无阳性反应；将35%、100%洗脱液洗脱蛋白与100%洗脱液直接洗脱蛋白行SDS-PAGE对比纯化效果，经改进后即35%、100%洗脱的HiTrap Protein G蛋白纯化方法所得多克隆抗体条带数目更少、目的条带更清晰，说明改进后得到抗体比直接洗脱效果更好，其原因可能为少量与IgG蛋白性质相近的蛋白可被纯化柱所吸附，在35%洗脱液条件下（pH约为4.3）即被洗脱，但具体机制还需进一步探究。与已有文献报道的其他抗体纯化效果比较，应用此法纯化抗体所得纯度明显高于辛酸－饱和硫酸铵提取法[14]、抗原吸附法[14]及 DEAE-Sephadex A50亲和层析法[15]，且Protien G柱可重复利用，不同种类抗体可共用一个纯化柱，降低了纯化成本；纯化系统自动进液与收集，电脑操作降低了人力消耗，操作简便。因此，此改进纯化方法即HiTrap Protein G 35%、100%二梯度洗脱效果较好，可推广应用于抗体纯化。

本研究结果显示：考虑到节约标记成本及后期FITC更易去除完全的原因，选择标记时FITC与蛋白量最佳比值为1∶10；在3种反应条件下，反应得到的荧光值比较差异无统计学意义；不同标记时间与标记温度下所得标记抗体的F485/535值接近，无需做差异性分析，即3种不同反应条件均对FITC标记无影响。考虑到抗体在低温下最易保持其与抗原反应的能力，本文作者将标记后抗体稀释1 000倍与抗原反应，结果发现：37℃条件下标记的抗体与抗原结合相对较少，菌体荧光不及其他条件下明亮，故不选择37℃、30min作为最佳反应条件；同时，由于4℃条件下进行搅拌反应需要具备的实验环境较难达到，且反应时间较长，故选择20℃、2h作为最佳FITC标记反应条件。

本实验中可见抗体不与S.aureus发生抗原抗体反应，也无明显荧光素吸附杂蛋白及目标菌之外其他菌体的情况发生，说明所制备的FITC标记多抗抗性良好、抗体纯度高、荧光强度高、持续时间长、特异性好，可应用于免疫荧光法检测E.coliO157∶H7。

综上所述，免疫荧光检测因其操作简便、检测时间短、灵敏性良好及特异性强等优点成为致病菌定性检测的一种重要方法。本实验改进了抗体纯化技术，优化了FITC标记抗体的条件，制备出的FITC标记抗体荧光强度高，持续时间长，特异性良好，为建立E.coliO157∶H7免疫荧光检测方法完成了关键步骤。

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