降低丝素蛋白/柠檬酸/乙二醇膜对水的pH值影响的方法

张伟国，庄高磊，田保中

(1.苏州大学纺织与服装工程学院，江苏苏州215021;2.现代丝绸国家工程实验室，江苏苏州215123)

作为茧丝纤维的主要成分，丝素蛋白具有优良的人体相容性、天然、来源广泛等优点，因此作为生物医学研究材料引起了国内外研究者的重视［1-3］。但是纯丝素膜存在“硬脆”的缺点，为使丝素膜具有软组织修复材料所要求的“柔软”性质，人们多采用交联的方法，然而已有系统的研究表明，常用的生物材料交联剂如戊二醛和环氧化合物均存在生物毒性［4］。柠檬酸分子具有1个羟基和3个羧基，采用柠檬酸作为交联剂有一定的可行性，但是从其近乎球状的分子形状初步判断，单独作为交联剂，效果可能比较差，所以选用了乙二醇或者聚乙二醇与其3个羧基反应制成交联剂［5］。有研究发现，丝素蛋白/柠檬酸/乙二醇膜(SFCE)的一个主要缺点是会显著降低水的pH值［5］，推测这是由于柠檬酸的3个羧基的反应能力很小存在太多游离羧基造成的。本文提出了两种降低SFCE膜对水的pH值影响的方法并研究了其机理及膜的力学机械性能。

1 试验

1.1 材 料

蚕茧(日本)，无水碳酸钠，无水氯化钙，无水乙醇，柠檬酸，乙二醇。试验所用药品均来自日本国和光纯药工业株式会社，级别为分析纯。

1.2 方 法

1.2.1 丝素溶液的准备

称取蚕茧茧壳，按1︰50(茧壳的质量︰溶液的体积)的浴比放入质量体积分数为0.05%碳酸钠溶液中，沸煮1 h，水洗干净，再重复2次，然后放入烘箱中，60℃鼓风烘12 h，得到纯丝素纤维。将纯丝素纤维在CaCl2—H2O—C2H5OH(摩尔比为1︰8︰2)三元溶剂中于(80±2)℃溶解，经过透析、过滤得丝素溶液。

1.2.2 膜样品制备

1)SFCE4膜制作:按照1︰4的摩尔比，将柠檬酸和乙二醇混合于烧杯中，在一定温度下加热15 min后，柠檬酸溶解于乙二醇中，形成透明黏稠状物质，该物质命名为CEG4。按照不同的质量比，将丝素蛋白溶液和CEG4在100℃加热形成均匀的溶液，移入塑料盒中，然后将其置于干燥箱内，60℃下干燥后，得到的膜标记为SFCE4膜。

2)SFCECa4膜制作:将制备好的SFCE4膜保留在原塑料盒中，然后向其中加入足量饱和CaCO3溶液，将已经盛有足量CaCO3粉末的透析袋置于其中。24 h后，盒内的水在60℃被蒸发完以后，得到的膜标记为SFCECa4膜。

3)SFACE4膜制作:按照1︰1︰4的摩尔比称取一定质量的柠檬酸、醋酸和乙二醇，然后将柠檬酸和醋酸混合置于密闭压力容器中，将密闭压力容器在120℃下放置2 h，获得一种黏稠物质AC。将制得的AC与乙二醇混合，120℃下加热15 min后，获得一种胶状物质，表示为ACEG4。按照设定的质量比，向盛有丝素蛋白溶液的烧杯中移入一定质量的ACEG4，然后将烧杯100℃下加热1 h，烧杯里的物质变成近乎澄清的溶液，然后将该溶液倒入塑料盒中，将塑料盒置于60℃干燥箱中，待溶液干燥成膜后取出。得到的膜标记为SFACE4膜。

1.2.3 膜对水的pH值影响

称取质量约为0.05 g的膜，按1︰200的浴比放入蒸馏水中(23±0.2)℃，立即用pH计测水的pH值并记录，直到水的pH值不再变化为止，据此作出水的pH-t曲线。

1.2.4 膜的 FTIR 谱

用Perkin Elmer 1600红外光谱仪(美国Perkin Elmer公司产品)测得膜的红外光谱。

1.2.5 膜的机械性能

样品膜的尺寸为10 mm×40 mm，每种膜的样品数量为10个。试验在ORIENTEC Universal Testing Machine上进行，夹距为20 mm，拉伸速度为20 mm/min，量程为50 N。试验环境:温度为25℃，相对湿度为60%。记录断裂强力和断裂伸长率，按如下公式计算膜的断裂强度P。

式中:P为膜的断裂强度，MPa;F为膜的断裂强力，N;d为膜的宽度，cm;h为膜的厚度，cm。

2 结果与讨论

2.1 膜对水的pH值影响

图1为膜对水的pH值影响。

图1 膜对水的pH值影响Fig.1 The influence of film on pH value of water

从图1可见，按照方法1)制备的SFCE4膜在很短的时间内将水的pH值降到了接近于3.00;按照方法2)制备的SFCECa4膜降低水的pH值速度比SFCE4膜慢些，经历23min后水的pH值恒定于4.13;按照方法3)制备的SFACE4膜在1 min内将蒸馏水的pH值从6.95提高到8.63，随后水的 pH值缓慢下降，5 min后下降到7.50以下，15 min后下降到并恒定为7.00±0.50。由此可知，用CaCO3溶液处理SFCE膜以降低SFCE膜对水的pH值影响效果不太理想。醋酸降低SFCE膜对水的pH值影响效果很理想。

柠檬酸分子有三个羧基，所以有较强的酸性，将乙酸和柠檬酸按1︰1的摩尔比混合加热后，乙酸分子上的羧基和柠檬酸分子上的羟基发生酯化反应生成的乙酯基增强了柠檬酸分子上羧基的反应能力。这三个羧基与乙二醇分子可以发生化学反应，形成比较稳定的酯键，因此醋酸与柠檬酸预先反应能够达到降低SFCE膜对水的pH值影响的目的。

2.2 膜的红外光谱

图2为膜的FTIR谱。从图2可见，SFCECa4膜和SFCE4膜的FTIR谱形状差别很小，吸收峰的位置基本相同，两个谱线可以完全叠合在一起，说明CaCO3几乎没有改变柠檬酸和乙二醇之间的结合状态。

图2 膜的FTIR谱Fig.2 FTIR spectra of film

SFCE4膜和SFACE4膜的FTIR谱存在四个区别，第一区别是:SFCE4膜在2 950 cm-1处的吸收带为2 938～2 966 cm-1，此为羧酸的羟基和—CH2—基的伸缩振动的贡献，SFACE4膜在此处附近的吸收带为2 876～2 934 cm-1，这是醋酸和柠檬酸之间形成的CH3—COO—C(C—)2即醋酸酯基(2 900 cm-1)、柠檬酸和乙二醇形成的酯基(2 876 cm-1)，以及残留的醋酸分子(2 934 cm-1)的贡献［6］，而且此区域也有—CH2—基伸缩振动吸收的贡献，只是由于醋酸与柠檬酸形成的醋酸酯基的作用，使得乙二醇的—CH2—基的伸缩振动峰的位置发生了红移。第二个区别是:SFACE4膜在1 088～1 130 cm-1出现了一个比较明显的吸收带，这是柠檬酸和乙二醇形成的酯基(1 100 cm-1)及醋酸和柠檬酸之间形成的醋酸酯基(1 130 cm-1)的贡献［6］，而 SFCE4不出现这个吸收带。第三个区别是:SFCE4膜在1 220 cm-1附近出现一个吸收带，这是游离的柠檬酸分子(1 220 cm-1)的贡献［6］，说明膜中存在相当量的游离柠檬酸分子，而SFACE4膜没有出现这个吸收带，说明SFACE4膜中的柠檬酸分子基本上已经和醋酸反应并形成了比较强的化学结合。第四个区别是:SFCE4膜在1 734 cm-1处出现一个明显的吸收峰，应该是游离的柠檬酸的羰基的伸缩振动峰［6］。

三种膜的FTIR谱均在1630 cm-1(酰胺Ⅰ)处出现β折叠型丝素，即丝素Ⅱ的特征吸收峰，说明在SFCE4、SFCECa4和SFACE4膜中均存在β折叠型丝素，这是因为在成膜过程中都有部分丝素发生了β结晶化。

CaCO3之所以能够降低SFCE膜对水的pH值影响，主要是溶解的CaCO3与柠檬酸分子上未发生酯化反应的羧基及游离的柠檬酸分子的羧基发生了反应，但CaCO3与羧基的反应能力有限，因此降低膜对水的pH值影响效果有限。醋酸可以和柠檬酸分子上的羟基发生酯化反应，形成的乙酯基在该分子上是一个推电子基，导致柠檬酸分子上的羧基易于离去一个—OH基，容易和乙二醇分子发生酯化反应，实际上“封闭”了柠檬酸分子的羧基，因此醋酸可以使SFCE膜完全不具有影响水的pH值的能力。

2.3 膜的力学机械性能

膜的机械性能尤其湿态下的机械性能，是软组织修复材料的一项重要指标。由于用CaCO3溶液处理得到的SFCECa4膜不能有效降低SFCE膜对水的pH值影响，所以无需研究方法二对SFCE4膜的机械性能的影响，本文仅研究醋酸对SFCE膜的机械性能的影响(表1)。

从表1可见，无论湿态还是干态，SFACE4膜的断裂强度都比SFCE4膜的断裂强度要大得多，这是因为醋酸与柠檬酸的羟基反应生成乙酯基增强了柠檬酸的羧基与乙二醇反应的能力，醋酸、柠檬酸和乙二醇反应生成的化合物与丝素蛋白分子之间可以发生化学交联，所以SFACE4膜的断裂强度比SFCE4膜大得多。按方法1)制备的SFCE4膜中存在较多的游离柠檬酸和乙二醇分子，可以起增塑作用，而且柠檬酸和乙二醇形成的物质和丝素分子之间的结合比较弱。因此总的来说，与干态的SFACE4膜的相比，干态的SFCE4膜的断裂伸长率较大。因为湿态时大量水分子的存在，两种膜的断裂伸长率非常接近。

表1 SFCE4 and SFACE4膜的机械性能Tab.1 Mechanical properties of SFCE4 and SFACE4 films

随着膜中丝素蛋白质量分数的减小，SFCE4膜的干态和湿态断裂强度是减小的，但干态SFCE4膜的断裂伸长率有所增大，这主要是因为膜中起增塑作用的小分子物质质量分数增大的缘故。SFACE4膜的干态断裂强度随着丝素蛋白质量分数的减小而有所增大，丝素质量分数为64%的SFACE4膜的干态断裂伸长率最大，但是丝素质量分数为71%的SFACE4膜的湿态断裂伸长率最大，达到224.4%，这个比例应该比较理想，因为对于软组织修复材料，湿态时的机械性能比干态时的更重要。

3 结论

CaCO3饱和溶液降低SFCE膜对水的pH值影响效果有限，因此，此方法不可取。醋酸与柠檬酸的羟基反应生成乙酯基能够提高柠檬酸的3个羧基的反应能力，导致柠檬酸的3个羧基可以与乙二醇分子发生酯化反应而被“封闭”，因此SFACE4膜对水的pH值几乎没有影响，可以满足软组织修复材料在这方面的要求。

FTIR分析证明，在SFCECa4和SFCE4膜中存在相当量的游离柠檬酸分子或者游离羧基，所以这两种膜对水的pH值有比较大的影响，在SFACE4膜中柠檬酸的羟基与醋酸反应生成了乙酯基，增强了柠檬酸分子上3个羧基的反应能力导致其羧基和乙二醇分子发生酯化反应而被封闭，所以SFACE4膜对水的pH值没有影响。

SFACE4膜的干态和湿态断裂强度均比SFCE4膜的大，这主要归因于醋酸增强了柠檬酸分子上3个羧基的反应能力及柠檬酸和乙二醇形成的化合物交联剂的反应能力。在丝素质量分数为71%时，SFACE4膜有较高的断裂伸长率。

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