外源钙对香菇富集重金属的抑制作用1）

李海波，魏海龙，胡传久，付立忠，吴学谦，吴庆其

（1.浙江省林业科学研究院，杭州 310023；2.浙江省医学科学院，杭州310013）

大型真菌对重金属生物富集现象的认识始于20世纪70年代蘑菇属（Agaricus）真菌内镉（Cd）的高水平积累的发现，随后人们纷纷发现很多大型真菌都具有较强富集重金属如汞（Hg）、Cd、铅（Pb）、砷（As）、铜（Cu）等的能力和作用。与绿色植物相比，食用菌能够积累更高浓度的铅Pb、Cd和Hg等有害重金属［1－4］。重金属在食用菌的不同生长发育期是必需元素，当处于痕量水平时可促进食用菌的生长，并维持所需重金属在体内的动态平衡；但是当重金属含量超过一定浓度时，则对食用菌形成胁迫毒害作用。香菇是著名的食（药）用大型真菌，其产量位居所有食用菌类的前三位，在我国食用菌出口贸易中占有重要地位。近年来有大量有关香菇等食用菌重金属含量的分析检测、背景值测算和富集规律的研究报道。这些研究均表明，香菇对于重金属元素Pb、Cd、Hg和As具有极强的富集能力，重金属可积累在香菇的子实体部分，并通过食物链进入人体，危害人体健康［5－12］。在自然界中，微量元素并不是单独存在的，而且在微量元素之间存在着相互制约的现象，影响着生物对它们的吸收利用。对重金属蓄积植物的研究表明，矿质元素钙（Ca）可以与重金属Cd竞争植物根系上吸收位点，从而降低植物对Cd的吸收［13］。添加外源Ca可以增强植物对许多非生物逆境的适应性，减轻逆境对植物所造成的伤害［14］，其机理可能是通过对有害矿质元素的拮抗作用［15］、维持较高的抗氧化保护酶系统活力［16］以及发挥钙信使系统的功能［17］等。因此，借鉴Ca对植物抗逆境的保护作用，通过外源Ca的添加来缓解重金属对香菇等栽培食用菌的胁迫毒害作用、抑制其对重金属的超量富集是值得探索的一条思路，但迄今为止，在食用菌研究领域，无论在基础研究层面上，还是应用技术层面上，尚缺乏矿质元素（如Ca、Mg、Zn）对重金属富集影响的研究，缺乏利用外源矿质元素对重金属富集的阻断技术研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 香菇菌种

香菇（Lentinual edodes）菌种939，由丽水市食用菌研究开发中心提供。

1.1.2 配方

（1）母种培养基配方：2% 葡萄糖、0.2% 酵母粉、0.1%KH2PO4、0.05%MgSO4·7H2O、琼脂若干。

（2）含重金属液体培养基配方：在含3% 豆饼粉、2% 葡萄糖、1% 酵母粉、0.5% 蛋白胨、1% 维生素B1、0.1%KH2PO4和0.05%MgSO4·7H2O的液体培养基基础上，分别添加Pb 150mg／L、Cd 20mg／L、As 5mg／L、Hg 20mg／L形成4种含重金属培养基。每种重金属培养基中分别添加浓度为0.1、0.5、1.5、3.0g／L的Ca2＋形成4个处理，不添加Ca2＋作为对照。

（3）含重金属栽培基质配方：在含78%木屑、20%麸皮，水适量的栽培基质基础上，分别添加如表1所示的重金属量。再在每种含重金属的栽培基质中分别添加1%、2%、4%、6%的含Ca2＋矿质添加剂形成4个处理，不添加Ca2＋矿质添加剂作为对照。栽培基质装袋制成15cm×55cm的香菇菌棒。

表1 不同重金属的添加量及菌棒实测值 mg·kg－1

1.1.3 试剂

4种重金属 Pb［Pb（CH3COO）2·3H2O］、Cd（CdCl2·2.5H2O）、As（As2O3）、Hg（HgCl2）和矿物质Ca（CaCl2）均购自浙江华东医药器化公司。添加在香菇培养基中的重金属离子和矿物质离子均按照分子量换算成相应的离子含量，按照添加量的浓度配制成标准溶液，其中Pb、Cd、Hg是溶于水中配制而成，As是溶于20%的氢氧化钠溶液中配制而成，矿物质Ca是溶于水中配制而成。

1.2 方法

1.2.1 液体培养方法：试验前将香菇菌种转接至PDA斜面活化，24℃培养5天。在500mL三角瓶中装200mL母种培养基，于121℃灭菌30min。从活化好的斜面菌种上取5块0.3cm×0.3cm大小菌种块接种三角瓶中，置摇床上培养（26℃，转速200 r／min）3天。之后取10%转接入含重金属的液体培养基，置摇床上培养（26℃，转速200r／min）25天后，纱布过滤，菌丝体蒸馏水冲洗后，3000r／min离心15min，弃上清液后，称重。每个处理设3个重复，每个重复10个摇瓶。

1.2.2 固体基质培养方法：在香栽培基质添加如表1所示的重金属和含Ca2＋矿质添加剂，装袋制成香菇菌棒，灭菌后接种香菇胶囊菌种，接种后的培养温度为25～26℃，按常规进行菌棒培养管理，采用高棚层架栽培模式进行出菇管理。出菇后收获子实体检测重金属含量。每个处理设3个重复，每个重复25个菌棒。

1.2.3 重金属含量检测方法：Hg总量测定（GB／T5009.17－2003）：冷原子吸收光谱法即五氧化二钒消化法检测；As总量测定（GB／T5009.11－2003）：氢化物原子荧光光度法检测；Pb总量测定（GB／T5009.12－2003）：石墨炉原子分光光度法进行检测；Cd总量测定（GB／T5009.15－2003）：石墨炉原子分光光度法进行检测。

1.2.4 统计学方法：采用SPSS 11.0软件，对所有数据均以平均均数±标准差（Mean±SD）表示，各处理间的比较采用最小显著差值法LSD－t检验，P＜0.05为差异有显著性。

2 结果与分析

2.1 Ca2＋对培养基污染Pb、Cd、As、Hg的香菇菌丝体生物量的影响

Ca2＋对培养基污染Pb、Cd、As、Hg的香菇939菌丝体生物量产生了较大影响（表2）。在含有Pb、Cd、As、Hg的液体培养基中生长的香菇939，在未添加Ca2＋时，其菌丝体生物量分别为0.014、0.245、0.410和0.0820g／100mL，添加 Ca2＋后，其菌丝体生物量呈现增加的趋势，当Ca2＋添加量达到3g／L时，培养基中含有Pb、Cd、Hg的香菇939的菌丝体生物量达到最大值，分别为0.709、0.85和2.332g／100mL，分别是未添加Ca2＋的50.6、3.5和5.7倍。在含As的培养基中，Ca2＋的添加量为0.1g／L时，香菇939的菌丝体生物量就达到了最大值0.44g／100mL，是未添加Ca2＋的5.4倍，继续增加Ca2＋的含量，菌丝体生物量呈现下降的趋势。这表明在4种重金属的胁迫作用下，香菇的生长均不同程度地受到抑制，而外源添加的Ca2＋可能通过离子拮抗作用降低了香菇子实体对4种重金属离子的大量吸收，进而减轻重金属对香菇的毒害作用。同时，在Ca2＋的拮抗效果上，Ca2＋对As富集的拮抗在低添加量（0.1g／L）时已达到最大，而对Pb、Cd、Hg富集的拮抗在高添加量（3.0g／L）时尚未达到最大。

表2 Ca2＋对培养基污染重金属的香菇939菌丝体生物量的影响 g·100mL－1

2.2 含Ca2＋矿质添加剂对香菇富集重金属Pb、Cd、As、Hg的影响

由表1可见，即使在香菇固体栽培基质中不添加任何浓度的重金属元素，但在菌棒中依然可以检出4种重金属Pb、Cd、As、Hg的存在，这表明香菇培养料（包括木屑、麸皮等）和产地环境中的土壤、水均含有一定浓度的重金属元素。在人为添加一定浓度的重金属元素后，菌棒中的4种重金属含量显示出了较大程度的增加，Pb、Cd、As、Hg分别由1.10、0.07、0.19、0.02增至35.06、1.20、6.45、0.89mg／kg干料重。这表明在香菇栽培过程中，外源污染的重金属元素在栽培菌棒中得到富集，在菌棒中高含量的重金属元素通过菌丝进一步向子实体迁移，进而导致子实体大量富集重金属。

我们近年来的研究结果已表明，香菇栽培基质中的重金属可以通过菌丝体的吸收、富集并进一步迁移到香菇子实体中，栽培者可以从源头上通过控制培养料中的重金属限量或阻断迁移途径来控制香菇子实体中重金属含量［18］。在本研究中，我们尝试通过使用含Ca2＋矿质添加剂来阻断香菇子实体对4种重金属的富集。由图1可见，在不添加含Ca2＋矿质添加剂时，香菇子实体中4种重金属Pb、Cd、As、Hg的含量分别为1.20、2.70、1.53、1.39mg／kg，随着含Ca2＋矿质添加剂在香菇培养料中添加浓度从1%、2%、4%到6%的逐步提高，4种重金属的含量呈不断下降趋势，在最高添加浓度为6%时，Pb、Cd、As、Hg的含量分别下降到了0.45、1.43、0.69和0.28mg／kg，分别降低了62.5%、47.0%、54.9%、79.9%。这表明Ca2＋可能通过离子拮抗作用降低了香菇子实体对4种重金属离子的大量吸收。对南美蟛蜞菊（Wedelia trilobata）毛状根毒害的生理机理研究表明10～30mM Ca2＋可显著减少毛状根对Cd2＋的吸收和吸附，并可调节其抗氧化酶活性，降低其膜脂过氧化水平而解除重金属Cd对毛状根生长的抑制或毒害［19］。此外，对金针菇、平菇的富集重金属研究表明，Cd与锌（Zn）之间存在互相拮抗作用［19］，Ca2＋、镁（Mg2＋）、铁（Fe2＋）对 Hg2＋抑制平菇菌丝生长的毒害有一定的拮抗解毒效果［20］。

图1 不同浓度含Ca2＋矿质添加剂对香菇富集重金属的影响

2.3 含Ca2＋矿质添加剂对香菇富集重金属影响的差异显著性

表3 含Ca2＋矿质添加剂对香菇富集重金属影响的差异显著性

由表3的LSD－t检验可见，含Ca2＋矿质添加剂对Pb、Hg、As 3种重金属富集的抑制作用在不同的浓度水平上均存在极显著差异；在对Cd富集的抑制作用上，4%和6%的含Ca2＋矿质用量与CK、1%、2%用量差异显著。这表明在香菇培养料中添加含Ca2＋矿质添加剂对Pb、Hg、Cd、As 4种重金属富集均有抑制作用，香菇子实体中Pb、Hg、Cd、As含量均会随着Ca2＋矿质添加量的增加而降低，但Cd只有在Ca2＋矿质添加量达4%和6%时，才明显降低。这一结果提示在香菇栽培生产中，可以通过在栽培基质配方中添加含Ca2＋矿质添加剂对Pb、Hg、Cd、As 4种重金属的富集进行阻断，但针对不同的重金属的阻断效果，添加含Ca2＋矿质的用量有所不同。

3 结论

3.1 香菇液体培养基中添加一定浓度的Ca2＋可以显著减轻4种重金属Pb、Cd、As、Hg对香菇生长的胁迫毒害作用，增加重金属胁迫下香菇菌丝体的生物量；

3.2 香菇栽培基质中添加一定量的含Ca2＋矿质添加剂可显著抑制子实体对4种重金属离子的大量富集；

3.3 本研究结果提示在香菇栽培生产中，可以通过在栽培基质配方中添加一定量的含Ca2＋矿质添加剂对4种重金属进行阻断。

［1］ Schmitt J A，Meisch H U，Reinle W.Heavy metals in higher fungi，II，manganese and iron［J］.Zeitschrift fur Naturforschung C，1977，32（9／10）：712－723.

［2］ Varo P，Lahelma O，Nuurtamo M，Saari E，Koivistoinen P.Mineral element composition of finish foods，vii.potato，vegetables，fruits，berries，nuts and mushrooms［J］.Acta Veterinaria Scandinavica，1980，22：89－113.

［3］ Vetter J.Mineral element content of edible and poisonous macrofungi［J］.Acta ali zagon civilne družbe，1990，19：27－40.

［4］ Mallikarjuna S E，Ranjini A，Haware D J，Vijayalakshmi M R，Shashirekha M N，Rajarathnam S.Mineral composition of four edible mushrooms［J／OL］.Journal of Chemistry，2013.http：／／dx.doi.org／10.1155／2013／805284.

［5］ 雷敬敷，杨德芬.食用菌的重金属含量及食用菌对重金属富集作用的研究［J］.中国食用菌，1990，9（6）：14－17.

［6］ 邢增涛，王晨光.食（药）用菌中重金属的研究进展［J］.食用菌学报，2000，7（2）：58－64.

［7］ 寇冬梅，陈玉成，张进忠.食用菌富集重金属特征及污染评价［J］.江苏农业科学，2007（5）：229－232.

［8］ 徐丽红，吴应淼，陈俏彪，等.香菇对栽培基质中有害重金属的吸收富集规律及临界含量值［J］.浙江农业学报，2007，19（3）：211－215.

［9］ 柴振林，吴学谦，魏海龙，等.浙江省鲜香菇背景值及质量安全评价［J］.中国食用菌，2008，27（4）：31－33.

［10］ 袁瑞奇，孟祥芬.平菇对重金属富集机理的研究［J］.河南农业大学学报，2006，40（2）：181－185.

［11］ 黄晨阳，张金霞.食用菌重金属富集研究进展［J］.中国食用菌，2004，23（4）：7－9.

［12］ 袁瑞奇，李自刚.食用菌栽培中重金属污染与控制技术研究进展［J］.河南农业大学学报，2001，35（2）：159－162.

［13］ Andersson A，Nillsson K O.Influence of lime and soil pH on Cd availability to plants ［J］.Ambio，1974，3（5）：198－200.

［14］ 姜义宝，李建华，方丽云，等.钙处理对苜蓿幼苗抗旱性的影响［J］.中国草地学报，2008，30（1）：117－120.

［15］ Skórzyńska－Polit E，Tukendorf A，Selstam E，Baszynski T.Calcium modifies Cd effect on runner bean plants［J］.Environmental and Experimental Botany，1998，40（3）：275－286.

［16］ 汪洪，周卫，林葆.钙对镉胁迫下玉米生长及生理特性的影响［J］.植物营养与肥料学报，2001，7（1）：78－87.

［17］ 汪良驹，刘友良，马凯.钙在无花果细胞盐诱导脯氨酸积累中的作用［J］.植物生理学报，1999，25（1）：38－42.

［18］ 魏海龙，吴学谦，曹群，等.重金属元素在香菇栽培基质和子实体中迁移特性研究［J］.中国食用菌，2009，28（3）：43－16，52.

［19］ 施和平，王云灵，曾宝强，等.外源钙对镉胁迫下南美蟛蜞菊毛状根生长、抗氧化酶活性和镉吸收的缓解效应［J］.生物工程学报，2012，8（6）：747－762.

［20］ 焦帅，阮榕生，刘玉环，等.Pb2＋、Hg2＋对平菇菌丝生长的影响及中微量元素对Hg2＋的拮抗解毒效应［J］.安徽农业科学，2010，38（1）：72－75，8.