不同提取工艺对金樱子黄酮体外抗氧化活性的影响1）

陈传平，彭成，方士英，陈乃东

（1.皖西卫生职业学院，安徽 六安237000；2.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安237012）

金樱子（Rosa laevigatae Michcx.），系蔷薇科蔷薇属常绿灌木的果实，在我国南方大部分地区均有分布，其中皖大别山区资源尤为丰富［1］。作为一种传统中药，金樱子可以治疗神经衰弱，高血压，慢性胃炎等多种疾病；在食品加工上还可生产保健饮料［2－4］。

黄酮类化合物广泛分布于植物界中，是一类重要的天然有机化合物，近年研究表明具有多种生理活性，如抗氧化、抗肿瘤、清除自由基、抗血小板凝集等［5－6］。金樱子中富含黄酮类化合物，且是其药理作用的主要成分之一，对金樱子黄酮（RFs）的提取常用方法有温水浸提、醇提、丙酮提及酶法等［7－8］，报道中主要围绕黄酮得率而进行，但对不同工艺所得黄酮活性还没有作进一步研究。本实验在采用不同工艺对金樱子黄酮类化合物提取的基础上，对每个组份进行体外抗氧化活性测试，并对结果进行比较，为进一步找到具有最佳生理活性的金樱子黄酮提供理论依据，以便更好地开发这种药食两用资源。

1 材料与方法

1.1 材料

金樱子：产地为皖六安市金寨县，采摘于2011年10月，自然晒干。

1.2 试剂与仪器

芦丁（Rutin上海生化试剂一厂）、石油醚、乙醇、硼氢化钠、水杨酸、FeSO4、AlCl3、NaOH、HCl、FeCl3、镁粉、NaNO2、Al（NO3）3等，均为分析纯。索氏提取器；数显恒温水浴锅（金坛市正基仪器有限公司）；751紫外－可见分光光度计（上海第三分析仪器厂）；精密电子天平（Precisa公司）；旋转蒸发器RE－52，上海青蒲沪西仪器厂；冷冻干燥机FD－1，北京博医康公司。

1.3 样品预处理

金樱子原料→洗净，去籽90℃烘干（48h）→粉碎，过40目筛→石油醚回流脱脂（60℃，2h）→挥干溶媒，备用。

1.4 不同提取工艺金樱子黄酮的制备

1.4.1 金樱子黄酮的提取

准确称取四份已脱脂的金樱子粉末5.0g，置锥形瓶中，分别加入水、60%甲醇、60%乙醇、60%丙酮500mL作提取剂，60℃回流提取2.5h，过滤，滤液减压浓缩后冷冻干燥，得水提金樱子黄酮（RF1）、甲醇提金樱子黄酮（RF2）、乙醇提金樱子黄酮（RF3）及丙酮提金樱子黄酮（RF4），待检测活性。

1.4.2 黄酮含量的测定

准确称取芦丁10mg加入80%的乙醇定容至100mL，移取芦丁溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0mL加70%乙醇定容至25mL，按文献［9］测铝盐光谱的操作进行，选择所测得的芦丁铝盐在可见光区吸光度最大时的波长作为入射波长测吸光度，用最小二乘法绘制工作曲线（见图1）。同样操作，测RFs液的吸光度，代入工作曲线求黄酮浓度。

图1 芦丁标准曲线

1.5 不同提取工艺的金樱子黄酮体外抗氧化活性测定

1.5.1 浓度选择

用1.4.2法跟踪测定，配制RFs浓度为25、50、100、200、400、800μg／mL6个浓度梯度，平行3份，一组空白作对照。

1.5.2 O2－清除率的测定

按文献［10］的方法，配制 AP－TEMED体系溶液（见表1），在AP－TEMED体系中产生O2－自由基，O2－与羟胺反应，生成 NO2－，NO2－经苯磺酸－α萘胺显色在520nm处有一吸收峰，其颜色深浅与产生的O2

—呈剂量效应关系。25℃时，取A液0.40mL，B液1.60mL（A∶B＝1∶4）混合，反应1min，加入不同浓度的AFs液，再加入10.00mmol／L的盐酸羟胺0.40mL，在25℃下反应25min，以不加AFs液为对照样，用分光光度计测A520值。AFs液对氧自由基的清除率计算公式如下：

清除率＝（C－D）／C×100%

C：对照液的A520值；D：加入不同浓度AFs待测液体系的A520值。

表1 AP－TEMED体系溶液配制表

1.5.3 ·OH清除率的测定

利用Fenton反应检测AFs对羟自由基（·OH）的清除作用［11］。计算公式如下：

·OH清除率＝（A0－AX×AX0）／A0×100%

A0为空白对照液的吸光度，AX为加入AFs液后的吸光度，AX0为不加显色剂H2O2AFs液本底的吸光度。

1.5.4 POV值的测定（GB／T5009.37－1996油脂卫生标准）

精密称取PG50mg、AFs粉各50mg，用适量60%乙醇溶解，加入到装有50g经熔化处理猪油的碘量瓶中，在65℃下搅拌30min，使抗氧化剂（AFs）均匀分散在油样中。塞紧瓶塞，置于65.0℃恒温箱中保存。每隔24h，将瓶中的油样搅拌均匀，测定其POV值。以不加AFs的油样为空白对照。平行3份，取平均值。计算公式如下：

式中：V1为试样消耗Na2S2O3标准溶液体积，V2为空白试验消耗Na2S2O3标准溶液体积，C为Na2S2O3标准溶液的摩尔浓度，M为样品质量。

1.5.5 统计学方法

所有实验数据采用均数±标准差（±s）表示，经SPSS13.0for windows数据包处理，组间差异比较采用t检验。

2 结果与讨论

2.1 不同提取工艺的金樱子总黄酮得率

从表2可看出，不同提取剂对金樱子总黄酮得率有一定影响，甲醇提取率最高，为5.49%，乙醇与之相近，水最低，只有3.75%，可能是黄酮类化合物的水溶性差所导致。考虑甲醇有毒，故可舍之而用乙醇提取。

表2 四种方法所提取的金樱子总黄酮得率

2.2 AFs的体外抗氧化性测试结果

2.2.1 金樱子黄酮对O2－及·OH清除率测试结果，见表3。

表3 金樱子黄酮对O2－和·OH的清除作用（X－±s，n＝3，%）

由表3可以看出，AFs在25～800μg／mL范围内对O2－和·OH有浓度依耐性清除作用，随着浓度的提高，清除率有所上升。在对O2－的清除作用中，AF3的活性最强，其线性关系y＝0.0744x＋2.1801，R2＝0.9954，半 清 除 率 浓 度 EC50为642.7μg／mL。对方程进行t检验，t＝29.43＞t0.001，4＝7.173，所以回归方程在0.001水平上显著。对·OH的清除作用中，AF1活性最强，而AF3仅次之，差别不是很大，其线性关系是y＝0.0318x＋3.793，R2＝0.9800，半 清 除 率 浓 度 EC50为1455.1μg／mL。方程t检验得t＝14.00＞t0.001，4＝7.173，回归方程在0.001水平上显著。

2.2.2 不同剂量的AFs在猪油中的抗氧化活性测试结果，见图2。

图2 金樱子黄酮在猪油中的抗氧化作用

从图2中可看出，在猪油中添加AFs，对猪油POV升高可明显抑制，说明AFs在猪油中有较好的抗氧化活性。但不同工艺提取的AFs，其抗氧化活性有所不同，其中AF3（即60%乙醇提取的金樱子黄酮）表现最活泼，而AF1（即水提取的金樱子黄酮）最弱。

综上所述，采用不同提取工艺所得的金樱子黄酮的体外抗氧化性有所不同，其中60%乙醇提取的金樱子黄酮活性最强。大部分黄酮的抗氧化作用的机理与其它酚类抗氧化剂相似，自身作为优良的供氢体，向活泼自由基提供氢后，形成的自由基可通过共振杂化与其它自由基结合成稳定的二聚体，从而切断链式反应，发挥抗氧化作用。因此，分子结构的差异决定了抗氧化活性的不同，不同提取工艺所得的金樱子黄酮其分子结构可能有一定的差异，本课题组将继续作深入研究。

3 结论

3.1 四种提取剂中，60%甲醇与60%乙醇提取AF得率较高并接近，故可而用60%乙醇进行提取。

3.2 四种提取工艺所得AFs的体外抗氧化活性不同，其中60%乙醇提取的AF对O2－的清除能力及在猪油中的抗氧化活性最强，水提取的AF对·OH清除率最高。

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