阿维A对硬皮病小鼠的治疗作用及机制研究

沈佚葳 王 京 周 平▲

1.首都医科大学附属北京世纪坛医院皮肤科，北京 100038；2.首都医科大学附属北京世纪坛医院中心实验室，北京 100038

系统性硬皮病（systemic sclerosis，SSc）是一种以皮肤及内脏器官纤维化或硬化，最后发展至萎缩为特点的结缔组织病[1]。在我国结缔组织病中硬皮病的发病率高，病因及发病机制复杂，治疗手段有效。维A酸类药物在表皮分化、真皮重建及皮肤炎症中发挥重要作用，临床上主要用于治疗银屑病、痤疮及角化过度性皮肤病。近年来，维A酸的抗纤维化作用逐渐得到认识，文献报道阿维A可缓解硬皮病患者皮肤硬化，且对皮肤硬化为主的移植物抗宿主病（GVHD）有效[2-3]。本试验利用博来霉素构建小鼠硬皮病模型，观察阿维A对皮肤和肺部纤维化的治疗作用。

辅助T细胞17（Th17）是一种新的T细胞亚群，主要分泌白介素（IL）-17和IL-6，其在自身免疫病和过敏性疾病中发挥重要的免疫调节作用。调节性T细胞 （Treg）与Thl7细胞均来源于共同的前体细胞CD4+T细胞，两者关系密切，Treg细胞主要分泌转化生长因子 （TGF）-β和IL-10，在免疫耐受的诱导中发挥重要作用，抑制自身免疫性疾病的发生[4]。文献报道硬皮病患者存在外周血Th17/Treg细胞体系失衡，本研究通过检测小鼠外周血Th17/Treg相关因子 IL-17、IL-6、IL-10、TGF-β1，探讨阿维 A 治疗硬皮病可能的机制，为硬皮病的发病机制及治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 6周龄雌性SPF BALB／c小鼠，体重16～20 g，共24只，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于北京大学实验动物中心，置于清洁级环境，普通饲料和水饲养。

1.1.2 主要实验试剂 注射用盐酸博来霉素（BLM），15 mg/支，产自日本化药株式会社。阿维A胶囊，10 mg/粒，产自重庆华邦制药公司。小鼠 IL-17、IL-10、IL-6、TGF-β1酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组、模型的建立及给药方法 24只小鼠随机分为对照组、硬皮病组和阿维A组，每组8只。实验前用脱毛膏将背部毛发去除，标记出一个1 cm×1 cm大小的注射区。参照文献[5]建立SSc动物模型:对照组以酸盐缓冲液（PBS）皮下注射，每次0.1 mL，每日1次，共4周；硬皮病组和阿维A组以300 μg／mL浓度的博莱霉素液皮下注射，每次0.1 mL，每日1次，共4周。同时，在开始皮下注射博莱霉素的当天，对照组、硬皮病组以0.9%NaCl灌胃，每日0.2mL，阿维A组则用0.5 mg/mL的阿维A溶液按照6 mg/（kg·d）剂量灌胃（依照人体给药剂量0.5 mg/（kg·d）换算成小鼠的治疗剂量为 6 mg/（kg·d），每日灌胃约 0.2 mL。

1.2.2 标本的留取 最后一次注射、灌胃24 h后，小鼠通过眼眶动脉放血处死，收集血液1～2 mL，以3000 r／min离心20 min，吸取上层血清，用 ELISA 法检测 IL-17、IL-10、IL-6、TGF-β1水平，按试剂盒操作说明书进行。取小鼠背部无毛皮肤及肺脏，投入10%甲醛溶液中固定、脱水、石蜡包埋，制作组织病理切片。

1.2.3 皮肤和肺部炎症、纤维化的观察及测定 皮肤及肺组织切片行HE染色，用病理图像分析软件测量皮肤厚度（表皮+真皮厚度），皮肤和肺部炎症按下述方法计分，0分:无；1 分:少许；2 分:轻度；3分:中度；4 分:重度。由两名病理科医生进行盲法阅片。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，符合正态分布的计量资料各组间比较采用方差分析。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠皮肤（背部注射部位皮肤）和肺部组织病理分析

皮肤组织病理切片HE染色显示，对照组小鼠皮肤结构完整，无明显炎症细胞浸润及胶原增生；硬皮病组小鼠皮肤厚度明显增厚，胶原纤维增生，多数单一核细胞浸润，毛囊皮脂腺等附属器减少；阿维A组皮肤厚度稍增厚，未见明显胶原增生，可见少量单一核细胞。

小鼠肺组织病理切片HE染色显示，对照组肺结构完整，无明显炎症细胞浸润；硬皮病组肺泡间隔明显增宽，淋巴细胞浸润，可见红细胞及渗出，支气管上皮增生；阿维A组肺泡间隔稍增厚，少量淋巴细胞浸润及渗出。

阿维A组皮肤厚度、皮肤炎症评分及肺炎症评分均明显低于硬皮病组，而与对照组无明显差异。三组皮肤厚度、皮肤炎症评分、肺部炎症评分见表1。

表1 各组小鼠皮肤及肺部病理情况比较（±s）

表1 各组小鼠皮肤及肺部病理情况比较（±s）

组别 只数 皮肤厚度（μm） 皮肤炎症评分（分）肺炎症评分（分）对照组硬皮病组阿维A组F值P值888108.94±26.00191.88±40.95140.25±20.2415.250<0.0010.25±0.062.00±0.760.75±0.017.846<0.0201.13±0.352.00±0.921.38±0.5212.342<0.002

2.2 小鼠血清 IL-17、IL-6、IL-10、TGF-β1含量

阿维A组血清IL-17、IL-6、IL-10水平明显低于模型组，而与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），而模型组、对照组、给药组三组血清TGF-β1差异无统计学意义（P>0.05）。见表 2。

表2 各组小鼠血清 IL-17、IL-6、IL-10、TGF-β1含量（pg/mL，±s）

表2 各组小鼠血清 IL-17、IL-6、IL-10、TGF-β1含量（pg/mL，±s）

注:IL:白介素；TGF-β1:转化生长因子 β1

组别 只数 IL-17 IL-6 IL-10 TGF-β1对照组硬皮病组阿维A组F值P值88852.42±6.9866.89±16.6250.69±11.724.109<0.03179.60±11.79118.68±22.6285.77±12.0613.307<0.00151.64±16.90131.07±22.5257.65±21.7437.103<0.001133.19±6.63137.56±9.00130.21±8.301.692<0.208

3 讨论

系统性硬皮病可引起广泛的皮肤硬化以及肺、肾、食管等多器官功能异常，多数患者预后不良。目前系统性硬皮病的治疗策略主要是基于本病发生的三种基本机制:①针对血管痉挛，用血管扩张剂如钙通道阻滞剂，和抗血小板聚集药改善外周血循环；②针对免疫激活，用免疫抑制剂阻止有害细胞因子的合成和释放，如环孢素，环磷酰胺，糖皮质激素等；③针对纤维增生和胶原沉积，用减少胶原合成和增加胶原酶的药物抑制或减少纤维化，如D-青霉胺、秋水仙碱、γ-干扰素等[1，5]。但这些药物仅能不同程度地缓解症状或有较大的副作用，使系统性硬皮病仍缺乏有效的治疗方法。

阿维A为人工合成的第二代维A酸类药物，具有调节细胞分化、抑制细胞增殖及调节免疫等作用。文献报道[2]口服阿维A酯治疗27例硬皮病样的慢性移植物抗宿主病取得了明显的疗效。Marcellus等[3]观察阿维A酯单用或联合其他药物治疗12例SSc，并与糖皮质激素、D-青霉胺、环孢素等药物治疗进行比较，结果显示使用阿维A酯治疗的患者，临床疗效优于其他药物治疗，而且起效快 （0.5个月）。崔盘根等使用阿维 A 0.5～0.6 mg／（kg·d）联合血管扩张剂或其他药物治疗6例SSc患者，收到了良好效果，治疗2周即可改善关节症状及皮肤硬化程度，且对SSc引起的某些内脏受累也有一定的疗效[6]。博来霉素构建的小鼠硬皮病模型，可以很好的模拟人SSc的临床特征，本试验发现使用阿维A治疗4周可以明显改善硬皮病小鼠皮肤和肺部炎症及纤维化，因此认为阿维A为治疗SSc颇具前景的药物。

Th17/Treg的发现更新了既往CD4+T细胞的研究以Th1/Th2为主要内容的观点。CD4+T细胞在TGF-β和IL-6的共同诱导下分化为Th17，分泌IL-17和IL-6，促进炎性反应和自身免疫性疾病；而在TGF-β单独的诱导下分化为Treg细胞，分泌TGF-β和IL-10，发挥免疫抑制及免疫调节作用[4]。近年来，Th17/Treg在SSc发病中的作用逐渐被人们所认识，万琳琳等[7]发现SSc患者外周血Th17细胞比例、血清IL-17水平与活动组SSc患者的病情活动度呈正相关，提示Th17胞亚群在活动期SSc患者体内扩增，其扩增与SSc活动密切相关。在博来霉素诱导的小鼠硬皮病模型中也发现Th17细胞通过IL-17、IL-6等细胞因子参与SSc的发病，且与疾病程度呈正相关[8]。本试验依照人治疗剂量[阿维 A 0.5mg/（kg·d）]换算为小鼠治疗剂量[阿维 A 6mg/（kg·d）]给予小鼠灌胃 4 周，显著改善硬皮病小鼠皮肤和肺部症状，且血清IL-17、IL-6也显著降低，提示阿维A对SSc的作用机制可能与影响Th17细胞有关。维甲酸相关 孤 独 受 体 （retinoid related orphan nuclear receptor，RORγt）是控制 Th17 细胞分化的转录因子[4]，RORγt诱导编码IL-17和IL-17F细胞因子基因的表达。当小鼠缺乏RORγt后，自身免疫性疾病发生率下降，Th17细胞数量也相应减少。文献报道部分维A酸类药物可与维甲酸相关孤独受体（ROR）结合，抑制该基因的表达[9-11]，因此推测阿维A治疗硬皮病的机制可能与药物结合RORγt有关，导致了IL-17降低，以达到治疗皮肤和肺脏纤维化的作用。本试验中，笔者还发现阿维A治疗组血清IL-10水平也显著降低，而IL-10的水平在一定程度上反映了Treg细胞的水平。因此认为阿维A不仅作用于Th17细胞，而也可能影响了Th17/Treg的平衡。

阿维A作为皮肤科常用药物之一，可明显改善硬皮病小鼠皮肤及肺部症状，为临床上治疗SSc提供了新的思路，其作用机制可能与影响Th17/Treg的平衡有关。笔者进一步将继续研究使用阿维A治疗后外周血Th17细胞、Treg细胞各占CD4+细胞的百分比，检测外周血单一核细胞中 IL-17、RORγt及叉头状螺旋转录因子 3（FoxP3）mRNA水平，以进一步明确阿维A对Th17/Treg的影响。

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