低声压级水平次声在大鼠心肌纤维化中作用及机制研究

宋国良 邵尤北 裴兆辉

南昌市第三医院心血管内科，江西南昌 330009

次声是频率低于可听声频率的声波（10-4～20 Hz）[1]。有研究发现，低声压级水平次声能够明显改善心肌梗死大鼠心脏功能，增加心肌局部一氧化氮含量，降低内皮素-1及血管紧张素Ⅱ的含量[2-5]。临床上缺血性心脏病治疗药物中，因血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）良好的治疗效果而备受瞩目。ACEI能够减轻心肌纤维化，防止左室扩张，降低死亡率。本实验拟观察低声压级水平次声对大鼠心肌纤维化的作用及机制，判断次声对心肌纤维化和心室重构的治疗效果，可为临床应用低声压级水平次声防治心血管疾病奠定基础，为临床提供新的心血管疾病康复治疗方法。

1 材料与方法

1.1 材料

Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠（中山大学动物实验中心提供），体重150～170 g，适应性喂养1周后开始实验。将SD按0.5%异丙肾上腺素（ISO，大连辉瑞制药有限公司）5 mg/（kg·d）皮下注射，连续10 d建立大鼠心肌纤维化（MF）模型。选择Infratoni-c8000TM次声治疗仪，为美国加州医师协会研制。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 将40只SD大鼠随机分4组，每组10只。①对照组:大鼠心肌纤维化模型建立后给予双蒸水（15mL/kg）灌胃。②药物治疗组:大鼠心肌纤维化模型建立后将卡托普利100 mg/kg，每天1次，用双蒸水（15 mL/kg）稀释后灌胃，连续4周。③次声治疗组:大鼠置于特制的鼠笼中，分别于 9∶00 及 15∶00，给予低频次声治疗 4 周，2 次/d，0.5 h/次。④药物和次声治疗组:大鼠心肌纤维化模型建立后卡托普利溶液灌胃，同时施加次声作用。

1.2.2 血流动力学指标的测定 治疗结束后，分离右颈总动脉和左股动脉，经右颈总动脉插入聚苯乙烯PE-20导管至心室，导管另一端经能量转换器连接MP A-2000多导生理记录仪，测定心率（HR）、左室收缩压（LVSP）、左室舒张压（LVEDP）、左室压力变化最大上升和下降速率（±LVdp/dtmax）。同时经股动脉插管记录动脉收缩压 （SBP）和动脉舒张压（DBP）。

1.2.3 大鼠心肌胶原测定 治疗结束后，动物采用29 g/L苯巴比妥钠腹腔注射麻醉，开胸经左心室至主动脉插管，剪破右心耳。先用200 mL的生理盐水冲洗，再灌注含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.4）500 mL持续1 h。取出左心室，在解剖显微镜下小心切取左心室浸入40 g/L多聚甲醛溶液中作为心肌胶原测定的标本。

1.2.4 心肌Ⅰ及Ⅲ型胶原检测 将心肌制作成石蜡切片，片厚5 μm；二甲苯脱蜡，经各级乙醇脱水，0.2%胃蛋白酶溶液37℃1 h，双蒸水洗涤5 min×3次，0.6%过氧化氢-甲醇溶液37℃ 30 min，双蒸水洗涤5 min×3次，磷酸盐缓冲液洗涤5 min×3次，加正常血清室温下20 min；加第一抗体（1∶100 Ⅰ型胶原抗体）37℃ 1 h，4℃过夜；PBS 洗涤 5 min×3次，滴加即用型envision置37℃烘箱40 min，PBS洗涤5 min×3次，加DAB溶液光镜观察下显色，水洗，0.5%甲基绿染色，用蒸馏水洗3次，37℃烘干，二甲苯透明，封片用同济医科大学清平影像公司MPIAS 500型彩色病理分析系统进行分析。Ⅲ型胶原:除第一抗体为1∶100Ⅲ型胶原抗体外，余同Ⅰ型胶原。

1.2.5 血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）测定 治疗结束后动物同上麻醉，体外心脏取血2 mL，用肝素抗凝，4000 r/min离心10 min，将血清放入-20℃冰箱保存待测。AngⅡ的含量采用高效液相色谱法测定[8]，试剂盒由中国原子能研究所提供。

1.2.6 血浆醛固酮放射免疫测定 腹主动脉取血2 mL，10 μL肝素抗凝，加样操作后，4℃保温15min，3500r/min离心15min，弃上清，测定各管沉淀的放射 Bi（cpm）。Bi/Bo（%）=[Bi（cpm）-NSB（cpm）]/[A1Bo（cpm）-NSB（cpm）]× 100%。以 Bi/Bo值为纵坐标，标准管浓度为横坐标，在半对数坐标纸上作图，画出标准曲线。未知标本管的醛固酮浓度，可根据其Bi/Bo值从曲线上查得。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，组内比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组左心室Ⅰ、Ⅲ型心肌胶原蛋白表达比较

与对照组比较，药物治疗组，次声治疗组、药物和次声治疗组大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达明显减少；次声药物治疗组较药物治疗组及次声治疗组大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达明显减少（P<0.01）。药物治疗组及次声治疗组心肌胶原蛋白差异无统计学意义 （P>0.05），见表 1。

表1 卡托普利和次声对大鼠左室心肌胶原积分光度的影响（μg/L，±s,n=10）

表1 卡托普利和次声对大鼠左室心肌胶原积分光度的影响（μg/L，±s,n=10）

注:与对照组比较，aP<0.05；与药物治疗组比较，bP<0.01；与次声治疗组比较，cP<0.01

组别 Ⅰ型胶原 Ⅲ型胶原对照组药物治疗组次声治疗组药物和次声治疗组2.78±1.001.26±0.35a 0.12±0.35a 0.78±0.25abc 1.09±0.260.72±0.19a 0.76±0.32a 0.52±0.29abc

2.2 大鼠血浆醛固酮及AngⅡ含量的变化

与对照组比较，药物治疗组、次声治疗组、次声药物治疗组大鼠心肌醛固酮及AngⅡ含量明显减少；次声药物治疗组较药物治疗组及次声治疗组大鼠心肌醛固酮及AngⅡ含量减少（P<0.01）。药物治疗组及次声治疗组心肌胶原蛋白差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

表2 大鼠血浆醛固酮及AngⅡ含量的变化（±s，n=10）

表2 大鼠血浆醛固酮及AngⅡ含量的变化（±s，n=10）

注:与对照组比较，aP<0.05；与药物治疗组比较，bP<0.01；与次声治疗组比较，cP<0.01

组别 醛固酮（μg/L） AngⅡ（ng/L）对照组药物治疗组次声治疗组药物和次声治疗组647.8±72.0506.0±78.0a 494.0±80.0a 478.0±82.0abc 18.3±3.214.1±1.8a 14.5±2.1a 12.5±2.4abc

2.3 大鼠血流动力学变化

2.3.1 大鼠SBP、DBP、HR、LVSP变化 与对照组比较，药物治疗组、次声治疗组、次声和药物治疗组SBP、DBP和LVSP差异有统计学意义（均P<0.05）；与药物治疗组及次声治疗组大鼠比较，药物和次声治疗组SBP显著降低，DBP和LVSP显著升高（P<0.01）。HR比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表 3。

表3 大鼠 SBP、DBP、HR、LVSP 指标观察（±s，n=10）

表3 大鼠 SBP、DBP、HR、LVSP 指标观察（±s，n=10）

注:与对照组比较，aP<0.05；与药物治疗组比较，bP<0.01；与次声治疗组比较，cP<0.01；SBP:动脉收缩压；DBP:动脉舒张压；HR:心率；LVSP:左室收缩压

组别 SBP（kPa） DBP（kPa） HR（次/min） LVSP（kPa）对照组药物治疗组次声治疗组药物和次声治疗组18.2±2.916.6±2.1a 17.3±2.4a 15.5±2.6abc 5.9±1.38.1±1.9a 8.7±2.1a 9.6±1.8abc 453±48432±48428±51426±5014.5±2.619.1±3.6a 18.3±2.9a 19.4±3.2abc

2.3.2 大鼠 LVEDP、LVdp/dtmax、-LVdp/dtmax变化 与对照组比较，药物治疗组、次声治疗组，次声和药物治疗组±LVdp/dtmax均显著升高 （P<0.05），LVEDP 显著降低 （P<0.05）；与药物治疗组及次声治疗组大鼠比较，药物和次声治疗组±LVdp/dtmax显著升高（P<0.01）。HR差异无统计学意义（P>0.05），见表 4。

3 讨论

心肌纤维化是一个复杂的病理过程，在心肌组织结构中胶原纤维过量积聚、其胶原浓度显著升高或胶原容积分数显著增加[6]，涉及肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）系统、免疫系统和多种细胞因子参与，在不同心脏疾病甚至同种疾病的不同类型心肌纤维化的形成机制有所不同。醛固酮促进心脏细胞的Ⅰ型和Ⅲ型胶原基因表达，使胶原合成增多[7-9]。

表4 大鼠 LVEDP、LVdp/dtmax、-LVdp/dtmax指标观察（±s，n=10）

表4 大鼠 LVEDP、LVdp/dtmax、-LVdp/dtmax指标观察（±s，n=10）

注:与对照组比较，aP<0.05；与药物治疗组比较，bP<0.01；与次声治疗组比较，cP<0.01；LVEDP:左室舒张压；LVdp/dtmax:左室压力变化最大上升速率；-LVdp/dtmax:左室压力变化最大下降速率

组别 LVEDP（kPa）LVdp/dtmax（kPa/s）-LVdp/dtmax（kPa/s）对照组药物治疗组次声治疗组药物和次声治疗组2.8±0.51.8±0.4a 1.9±0.5a 1.4±0.3abc 746±66926±70a 935±68a 955±72abc 622±72748±66a 752±60a 770±64abc

本实验结果显示，卡托普利及次声治疗4周后，药物或次声治疗组大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型行胶原蛋白表达明显减少，AngⅡ及醛固酮明显减少，心肌纤维化明显减轻。药物和次声合用治疗，大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ行胶原蛋白表达明显进一步减少，AngⅡ及醛固酮明显进一步减少，心肌纤维化进一步减轻。血流动力学结果表明，药物或次声治疗均能改善大鼠血流动力学，发现药物组及次声组大鼠心肌纤维改善程度无明显差异，提示低声压级水平次声治疗大鼠心肌纤维化有效，改善心室重构。美国许多医师使用次声治疗仪辅助治疗创伤、瘢痕、炎症等疾病时，发现低声压级水平的次声可以促进血液循环、扩张血管、减少纤维性瘢痕增生、消退炎症及加速伤口的愈合[9-12]。本实验结果可能与低声压级水平次声上述作用有关。

心肌纤维化涉及RAAS系统及多种细胞因子参与，在不同心脏疾病甚至同种疾病的不同类型心肌纤维化的形成机制有所不同。心肌纤维化导致心室重构，常伴随发生高血压、心肌梗死及心力衰竭等疾病。心肌出现纤维化时AngⅡ的含量明显增加，使心肌纤维化加重；醛固酮分泌增加，促进心脏细胞的Ⅰ型和Ⅲ胶原基因表达，使胶原合成增多[5]，降低心肌间质胶原分泌，减缓细胞间质胶原堆积和纤维化进程。低声压级水平次声减轻心肌纤维化可能在于:①本实验结果表明低声压级水平次声可使血浆AngⅡ分泌降低，醛固酮分泌减少，使心肌Ⅰ、Ⅲ行胶原蛋白表达明显降低，减轻心肌纤维化。②本实验结果表明低声压级水平次声改善心脏血液动力学参数，增强心肌收缩力，改善心功能。

综上所述，通过对低声压级水平次声在大鼠心肌纤维化中作用研究，发现低声压级水平次声可改善大鼠心肌纤维化及心室重构，联合应用ACEI治疗，其效果进一步得到巩固，可能与胶原蛋白表达，血浆醛固酮及AngⅡ有关，研究结果可为低声压级水平次声康复治疗心血管疾病提供实验依据，为心血管康复治疗提供新途径。且低声压级水平次声治疗价格低廉，对我国广大城乡患者而言，经济且易于普及，具有重要现实和社会意义。

[1]Zhuang Z，Pei Z， Chen J.Infrasound-induced changesons exual behavior in male rats and some underlying mechanism[J].Env Tox-icol Pharmacol，2007，23（121）:111-114.

[2]吴敬国，梁艳冰，唐皓，等.低声压级水平次声对心肌梗死大鼠心肌纤维化的影响及机制研究[J].心脏杂志，2010，22（6）:852-854.

[3]刘召红，初国良，朱妙章，等.低声压级水平次声对心肌梗死大鼠心功能的影响及机制[J].心脏杂志，2009，21（5）:665-668.

[4]Voloshenyuk TG，Hart AD，Khoutorova E，et al.TNF-α increases cardiac fibroblast lysyl oxidase expression through TGF-β and PI3Kinase signaling pathways [J].Biochem Biophys Res Commun，2011，413（2）:370-375.

[5]Pan Z，Sun X，Shan H，et al.MicroRNA-101 inhibited postinfarct cardiac fibrosis and improved left ventricular compliance via the FBJ osteosarcoma oncogene/transforming growth factor-β1 pathway[J].Circulation，2012，126（7）:840-850.

[6]高淑卿，朱鹏立.心肌纤维化的研究进展[J].医学综述，2009，15（2）:1627-1629.

[7]Yu J， Fei J， Azad J， et al.Myocardial protection by Salvia miltiorrhiza Injection in streptozotocin-induced diabetic rats through attenuation of expression of thrombospondin-1 and transforming growth factor-β1[J].J Int Med Res，2012，40（3）:1016-1024.

[8]Lei B，Hitomi H，Mori T，et al.Effect of efonidipine on TGF-β1-induced cardiac fibrosis through Smad2-dependent pathway in rat cardiac fibroblasts[J].J Pharmacol Sci，2011，117（2）:98-105.

[9]Nadal JA，Scicli GM，Carbini LA，et al.AngiotensinⅡ stimulates migration of retinal microvascular pericytes:invo-lvement of TGF-beta and PDGF-B B[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2002，282（2）:739-748.

[10]陈景藻.次声的产生及生物学效应[J].国外医学:物理医学与康复分册，1999，19（1）:15-17.

[11]Pei ZH，Sang H，Li R ，et al.Infrasound-i nduced hemodynamics，ultrastructure and molecu lar changes in the rat myocardium[J].Environ Tox icol，2007，22（2）:169-175.

[12]裴兆辉，丁红新，陈景藻，等.次声对大鼠心率与血压影响实验观察[J].军事医学科学院院刊，2005，29（3）:208-210.