针刺任督脉对脑缺血再灌注大鼠血管内皮生长因子和C D3 4表达的影响

穆桂萍 曾瑶池 陈鹏典 罗文舒 马晓明 徐绍钢 刘心亮 刘文赫

广州中医药大学附属深圳市中医院，广东深圳 518033

脑缺血再灌注后，脑血管新生在脑组织损伤后结构重建和神经功能恢复中发挥着重要作用。针刺任督脉经穴对脑缺血的治疗作用有多靶点、多层次、多水平等特点，对脑缺血后神经再生具有积极的效应[1]。基于前期研究基础，本研究拟观察针刺任督脉经穴对脑缺血血管内皮生长因子（VEGF）蛋白和CD34表达的影响，探讨针刺任督脉经穴治疗脑缺血再灌注的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年健康雄性 SD 大鼠54只，体重（220±20）g，由广东省实验动物中心提供，许可证号:SCXK（粤）2008-0002。大鼠饲料为广东省实验动物中心提供的富含多种成分的配方。饲养于深圳市中医院中心实验室提供的动物房，环境温度26℃，湿度6%。

1.2 大鼠MCAO模型的建立

参考Kuge等[2]造模法，按 300 mg/kg水合氯醛腹腔麻醉，消毒剃毛后在蔡司体视显微镜下，锐钝结合分离皮下组织，暴露右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA），应用日本制尼龙线（直径 0.205 mm）插入ICA阻断CCA血流，缺血2 h后拔出线栓形成缺血再灌注。再灌后参考Longa神经病学评分[3]评定大鼠神经功能缺损，评分为1～4分则表示造模成功，可用于实验。

1.3 实验动物电针方法

针刺任督脉组大鼠在术后第2天起给予针刺，穴位选取任脉穴位承浆、气海、关元及督脉穴位百会、水沟和大椎，共6穴，穴位定位参照《实验针灸学》[4]中以上6个穴位取穴标记的方法，针刺后予SDZ-Ⅱ型华佗牌电针仪加电，疏密波刺激（疏波 30 Hz，密波 100 Hz），强度 5 V，以身体相应部位出现轻微颤动为准。持续时间为20 min。假手术组和模型组大鼠于术后第2天将其同其余实验组大鼠般固定于针刺操作台上20 min，不给予针刺。每天1次，分别于术后的第7、14、28天处死。

1.4 取材

各组的大鼠在各个时间点经麻醉后，先予生理盐水心脏灌注，再予4%多聚甲醛心脏灌注后固定，冠状石蜡切片，片厚10 μm。微波炉抗原修复，兔抗VEGF一抗或兔抗CD34一抗 （北京博奥森生物技术有限公司）4℃过夜，PBS冲洗，滴加即用型MaxvisionTM试剂，室温下孵育20 min，PBS冲洗，DAB显色，显微镜200×视野观察照相。

1.5 统计学方法

采用统计软件SPSS 12.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，组间比较采用q检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物分组

将54只实验动物随机分为假手术组、模型组及针刺任督脉组。各组分别随机分为7 d组、14 d组和28 d组3个亚组，每亚组6只。

2.2 针刺任督脉对脑缺血VEGF表达的影响

结果表明，假手术组3个时间点的VEGF表达平均灰度值相当，均为189左右，提示其阳性细胞数相当 （P>0.05）。模型组和针刺任督脉组随着缺血再灌注时间的延长，其平均灰度值逐渐增多，模型组7 d时最低（169.97±2.42），14 d 时增多 （175.83±1.72），28 d 时最高 （179.00±2.19），同样的针刺任督脉组 7 d 时最低（155.50±2.70），14 d 时增多（165.67±1.90），28 d 时最高（169.83±2.40）。假手术组、模型组VEGF的表达在7、14及28 d差异均有高度统计学意义（均P<0.01）；假手术组、针刺任督脉组VEGF的表达在7、14 d及28 d差异均有高度统计学意义（均P<0.01）。提示VEGF蛋白阳性细胞逐渐减少，但相对于模型组，针刺任督脉组数值上有明显优势（P<0.05）。

2.3 针刺任督脉对脑缺血CD34表达的影响

实验结果表明，假手术组3个时间点比较，其CD34表达平均灰度值相当，提示其阳性细胞数相当（P>0.05）。模型组和针刺任督脉组在脑缺血再灌注7 d时其CD34表达平均灰度值明显减少，14 d时最低峰，28 d时又增多，提示与假手术组比较，模型组和针刺任督脉组CD34阳性细胞数明显增多，14 d时达高峰后逐渐减少，但相对于模型组，针刺任督脉组数值上有明显优势（P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠CD34表达的平均灰度值（±s，n=6）

表1 各组大鼠CD34表达的平均灰度值（±s，n=6）

注:与假手术组比较，①P<0.01；与模型组比较，②P<0.01

组别 只数 7 d 14 d 28 d假手术组模型组针刺任督脉组181818200.00±2.37180.17±2.79①164.17±2.99②200.83±2.23164.17±2.86①144.83±2.48②199.67±2.66180.00±2.61①163.50±2.88②

3 讨论

脑缺血再灌注损伤后，及早恢复缺血半暗带区血供及促进新生的微血管和侧支循环的重建，有利于改善脑缺血情况，减少神经元凋亡坏死。因此，血管新生成为脑缺血后治疗的关键环节之一，可通过药物或其他途径促进缺血组织在原有微血管基础上形成新的毛细血管，并和原血管网相交汇以利于改善血供[5-6]。大量研究[7-8]表明，脑缺血缺氧可诱导VEGF、CD34及其受体的上调表达，并激活其血管再生和保护神经元机制。VEGF作为一种内皮细胞特异的有丝分裂原，通过和其受体结合而促进内皮细胞增殖，加速血管新生和提高血管通透性；而CD34（内皮前体细胞，EPCs）能分化为内皮细胞，定向迁移到缺血或损伤部位并参与局部的血管新生[9]。VEGF对EPCs的活性具有重要的作用，在缺血缺氧条件下可动员EPCs[10-12]。针刺任督脉提高了VEGF和CD34的表达，从而促进血管新生，提高血管通透性，因此，探讨脑缺血后VEGF和CD34表达情况及电针对其干预作用意义重大。

从中医角度上看，任脉为阴脉之海，主妊养生殖；而督脉为阳脉之海，主统率阳气。针刺任督脉研究在针灸治疗中风的应用也越来越深入，在治疗上也取得了令人满意的疗效[13]。前期研究表明，针刺任督脉穴位可持续性促进脑缺血大鼠脑内神经干细胞增殖分化为神经元[14]，针刺任脉经穴可持续性上调脑内一系列神经生长因子的表达[15]，而针刺督脉可抑制神经元凋亡[16]。而以上这一系列的结果，可能与促进局部微血管新生有关。本研究结果表明，针刺任督脉治疗在脑缺血再灌注7 d可分别上调脑内VEGF蛋白和CD34表达，提示针刺任督脉治疗脑缺血，可能通过上调VEGF蛋白和CD34表达，促进微血管新生，这可能为其抗脑缺血再灌注损伤的作用机制之一。

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