Arp2/3复合物表达沉默对胶质瘤细胞侵袭和迁移的影响☆

刘志峰杨学军刘彬陈聪任炳成王垒垒赵恺于圣平明浩朗朱蒙

多形性胶质母细胞瘤（gliobiastoma multiforme,GMB）患者的5年生存率仍然不到10%，对于年长的患者来说生存率更低[1]。对周围脑组织的广泛浸润以及复发是恶性胶质瘤难以根治的原因。胶质瘤细胞的侵袭和迁移是恶性胶质瘤不断进展的关键环节，而肿瘤细胞前端片状伪足的形成在细胞运动过程中的作用至关重要。肌动蛋白相关蛋白2/3复合物(actin-related protein 2/3 complex,Arp2/3 complex)能够绑定到肌动蛋白丝的侧面诱导肌动蛋白分支的形成，随着肌动蛋白分支的延长,其与对应的细胞质膜形成片状伪足[2]。在一些肿瘤组织和侵袭性细胞中，Arp2/3 mRNA及其蛋白水平表达发生了上调。在小细胞肺癌中Arp2/3的表达情况与癌症的预后呈负相关。有研究发现通过RNA干扰Arp2/3活性之后可以显著抑制前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力[3]。本研究利用RNA干扰技术沉默Arp3表达，从而抑制Arp2/3的活性，观察其对胶质瘤细胞迁移和侵袭行为的影响。

1 材料与方法

1.1 研究对象 细胞系为人胶质瘤U251细胞，购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所细胞库。siRNA寡核苷酸购自上海吉玛制药公司。实验所需引物购自大连TaKaRa公司。RIPA裂解液购自江苏碧云天生物技术研究所。小鼠抗人GAPDH单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。逆转录试剂盒购自北京天根公司。4%多聚甲醛购自索来宝公司。小鼠抗人Arp3单克隆抗体购自美国Abcam公司。Lipofectin-2000TM、TRI zol、兔抗人 p34抗体、Alexa Fluor标记的山羊抗兔荧光二抗及罗丹明鬼笔环肽购自美国Invitrogen公司。Marigel基质胶购自美国BD公司。Transwell板购自美国corning公司。

1.2 细胞培养及分组 人胶质瘤U251细胞使用含10%新生胎牛血清的DMEM培养基培养，内加青霉素100U/mL，链霉素100g/L，置于5%CO2、饱和湿度、37℃恒温培养箱内培养。实验分为3组：siRNA-Arp3组（转染siRNA-Arp3干扰片段）、siRNA-NC组（转染对照siRNA片段）、siRNA-N组（空白对照组）。转染所需寡核苷酸序列分别为siRNA-Arp3:5’-UCAUCCCUUCCUGUAUUGCUAUUAA-3’及siRNA-NC：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。

1.3 逆转录酶-多聚酶链反应（reverse transrip⁃tase-polymerase chain reaction,RT-PCR）检测Arp3 mRNA表达水平 按Trizol试剂盒说明书分别提取转染后48 h siRNA-Arp3组、siRNA-NC组和siRNA-N组细胞的总RNA。RT-PCR反应按照反转录PCR试剂盒说明书进行操作。PCR扩增条件为：94℃预变性 5 min；94℃ 30 s，退火 49℃30 s，延伸72℃ 30 s,共35个循环；最后延伸72℃5 min。Arp3上 游 引 物 ：5’-ATGCCCGGCTGAAATTAAGTGA-3’；下游引物：5’-TGGAAGCCAGCATTGATCCTC-3’。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceradehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）作为内参照（退火温度54℃，其余反应条件同前）。GAPDH上游引物：5’-AGGTCCACCACTGACACGTT-3’,下游引物：5’-GCCTCAAGATCATCAGCAAT-3’。PCR反应结束后取10µL反应产物行1%琼脂糖胶电泳观察目的片段。相对表达量计算公式为：目的基因条带灰度/内参条带灰度，U251－siRNA细胞ARP3表达抑制率用以下公式计算：抑制率＝[1－(siRNA－Arp3组 Arp3相对表达量/siRNA－N组Arp3相对表达量)]×100%。

1.4 细胞总蛋白提取 分别收集转染后48 h的siRNA－Arp3组 、siRNA－NC 组 和 siRNA－N 组 细胞，用4℃预冷的PBS洗涤细胞2次，每大皿细胞加入 400µL 裂解液（PMSF:RIPA＝1:100）,置于冰上裂解30 min;将裂解液转移至离心管中4℃离心，12000r/min，15 min;吸取上清液并测量蛋白浓度，与含DTT的上样缓冲液（DTT:上样缓冲液＝1:4）等体积混合后煮沸18min；分装储存于－20℃。

1.5 Western blot检测各组Arp3的表达量将不同组样品蛋白等量上样于12%SDS－PAGE凝胶上进行电泳，开始电压为80V，溴酚蓝进入分离胶层时调至120V,待溴酚蓝接近至凝胶底部时停止电泳[电泳缓冲液为 1×Ttis－甘氨酸缓冲液（pH7.9）],300 mA恒流湿转将蛋白由凝胶转到PVDF膜上，膜在室温下用5%脱脂奶粉封闭液封闭2 h，加入小鼠单克隆Arp3抗体（1:1000）,4℃孵育过夜，PBST洗3次，接着醋酸纤维膜在室温下与辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgG二抗（1:2000）孵育1 h,PBST洗膜3次后将增强化学发光液(ECL)均匀涂于PVDF膜表面显影，凝胶成像系统采集图像，最后将结果进行图像分析，计算吸光度（A）值。采用Quantity One软件分析条带的灰度值，以GAPDH作为内参。

1.6 细胞免疫荧光检测Arp2/3的细胞定位及细胞片状伪足的变化 转染后48 h的siRNA－Arp3组、siRNA－NC组和siRNA－N组细胞分别用预温37℃PBS洗两次，4%多聚甲醛固定15min，PBS洗3次，5%BSA封闭30min，加入1:100稀释的兔抗人p34抗体，4℃过夜；弃一抗，PBS冲洗3次；滴加1:100稀释的FITC/TRITC标记的山羊抗兔荧光二抗，37℃孵育1h；弃二抗，PBS冲洗3次；滴加1:40稀释的罗丹明鬼笔环肽室温孵育20min；PBS冲洗 3 次；DAPI染核 5min;0.5 mol/L Na2CO3－50%甘油风封片，荧光显微镜下观察并进行图像采集。

1.7 Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力每个Transwell小室上表面加入DMEM稀释好的Matrigel(Matrigel与DMEM体积比1:2)70µL，37℃孵育30min。将细胞消化好后重悬于无血清的DMEM中，在上室中加入100µL密度为1×105个/mL的细胞悬液，下室中加入600µL含血清培养基。常规培养48 h后，行结晶紫染色。用棉签擦去滤膜上层细胞，DP70倒置相差显微镜（×100）观察穿过膜的细胞数，随机计数5个视野中细胞数目，计算每个视野内的穿过聚碳酸酯膜微孔细胞数。

1.8 划痕实验检测细胞迁移能力siRNA－Arp3组、siRNA－NC组和siRNA－N组细胞分别接种于六孔板中，待其贴壁之后使用200µL枪头尽量垂直于六孔板底部划痕，PBS洗3次去除划下的细胞，加入培养基后用倒置相差显微镜记录此时及培养48h后细胞的迁移情况，每组重复实验3次。

1.9 统计学方法采用SPSS17.0进行统计分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK检验。检测水准α=0.05。

2 结果

2.1 RT-PCR、western blot验证不同处理组中Arp3 mRNA和蛋白的表达情况半定量RT-PCR结果显示，三组细胞的Arp3 mRNA相对表达水平分别为：19.33%±2.08%、97.33%±2.38%和96.67%±2.52%（图1）。siRNA-Arp3组细胞与siRNA-N组U251细胞相比，抑制率达80%（P＜0.01）；而siRNA-NC组与siRNA-N组细胞的Arp3 mRNA表达水平之间的差异无统计学意义（P=0.73）。Western blot分析不同处理组Arp3蛋白表达情况，使用GAPDH作为内对照，结果发现siRNA-NC组、siRNA-N组和siRNA-Arp3组细胞Arp3蛋白相对表达量分别为85.33%±3.21%、84.33%±4.04%和20.00%±3.00%，差异有统计学意义（F=353.62,P＜0.01），并且siRNA-NC组与siRNA-N组之间的差异无统计学意义（P=0.74）。siRNA-Arp3组细胞Arp3蛋白表达抑制率为76%，和mRNA表达变化情况基本一致。

2.2 转染Arp3-siRNA对U251细胞片状伪足的影响 红色荧光代表肌动蛋白，绿色荧光代表Arp2/3复合物，p34用于Arp2/3的定位（图2）。与siRNA-NC组和siRNA-N组相比，siRNA-Arp3组细胞前端片状伪足明显变小甚至消失。

2.3 转染Arp3-siRNA对细胞侵袭和迁移能力的影响 Arp3-siRNA转染U251细胞后使其侵袭能力受到抑制（图3，表1），侵袭至Transwell小室滤膜下表面平均每个视野穿膜细胞数在siRNA-Arp3组（42.33±3.51）、siRNA-N组（135.33±3.06）和siRNA-NC组（140.67±4.04）之间的差异有统计学意义（F=175.65,P＜0.01）。其中siRNA-Arp3组与siRNA-NC组（P＜0.01）和 siRNA-N 组（P＜0.01）之间的差异有统计学意义，而siRNA-NC组和siRNA-N组之间的差异无统计学意义（P=0.68）。划痕实验（图3，表2）中siRNA-Arp3组面积愈合率（17.67%±3.05%）、siRNA-NC组面积愈合率（80.33%±5.51%）和siRNA-N组面积愈合率（78.33%±5.03%）之间的差异有统计学意义（F=724.21，P＜0.01）。其中 siRNA-Arp3组与 siRNA-NC组（P＜0.01）和siRNA-N组（P＜0.01）之间的差异有统计学意义，而siRNA-NC组和siRNA-N组之间的差异无统计学意义（P=0.12）。

表1 同一时间各组中小室滤膜下表面的细胞个数（±s）

表1 同一时间各组中小室滤膜下表面的细胞个数（±s）

1）与siRNA-Arp3组比较，单因素方差分析，P<0.05

组别siRNA－Arp3组siRNA－NC组1)siRNA－N组1)n333 48 h 42.33±3.51 135.33±3.06 140.67±4.04

表2 同一时间各组创面愈合率（%，±s）

表2 同一时间各组创面愈合率（%，±s）

1）与siRNA-Arp3组比较，单因素方差分析，P<0.05

组别siRNA－Arp3组siRNA－NC组1)siRNA－N组1)n 3 3 3 48 h 17.67±3.05 80.33±5.51 78.33±5.03

图1 转染48h后各组Arp3 mRNA和蛋白的表达注：1.siRNA-Arp3；2.siRNA-NC；3.siRNA-N

图2 免疫荧光显示各组细胞Arp2/3的定位情况及细胞形态的改变（×400）

图3 Transwell侵袭实验和划痕实验分别检测每组细胞侵袭能力（×100）和迁移能力（×40）

3 讨论

肿瘤细胞从原发部位迁移是恶性肿瘤转移的标志，往往会导致肿瘤复发以及治疗失败，这一点在恶性胶质瘤中尤其明显[4]。胶质母细胞瘤是最常见及恶性级别最高的原发恶性脑肿瘤，占到所有颅内肿瘤的12%～15%，星形细胞肿瘤的60%～75%。尽管适形外照射与替莫唑胺同步治疗及随后的替莫唑胺辅助化疗方案应用于胶质母细胞瘤患者取得了一定效果，但胶质母细胞瘤患者的两年病死率仍高于70%[5-9]。恶性胶质瘤广泛浸润到相邻脑组织以及容易复发的趋势使其难以根治。即使肿瘤在影像学全切除之后，80%以上的胶质母细胞瘤会在原发肿瘤边缘2 cm以内复发[10-12]。因此，寻找更好的治疗方法，如：有效控制疾病进展和复发非常紧迫，其中方法之一就是控制胶质瘤细胞的侵袭和迁移。

研究表明[13]，相对于静止细胞来说运动中的细胞能更有效抵抗凋亡刺激。如果我们能抑制胶质瘤细胞的侵袭和迁移，把胶质瘤的侵袭性生长方式转换成局部生长，这将大大改善胶质瘤患者的预后效果。过去几十年，我们对细胞迁移机制的了解取得了显著地进步。总的来说，细胞迁移包括：前端突起的形成、细胞粘附到胞外基质、胞体的移动和尾部的收缩。值得注意的是，细胞前端的突起是细胞迁移的核心结构之一[14]，进一步支持了本实验研究结果。本课题组采用RNA干扰技术沉默Arp3的表达，通过RT-PCR、western blot验证发现siRNA-Arp3组U251胶质瘤细胞中Arp3 mRNA和蛋白的表达明显受到抑制，说明siRNA能特异性的抑制Arp3的表达。本课题组进一步采用细胞免疫荧光的方法检测Arp2/3定位情况以及转染Arp3-siRNA后对细胞形态的影响。研究结果显示在siRNA-NC组和siRNA-N组U251胶质瘤细胞中其前端突起朝向划痕区域或细胞密度较少区域并且Arp2/3定位到U251胶质瘤细胞的前端突起，而在siRNA-Arp3组U251胶质瘤细胞中前端突起变小甚至消失。上述结果说明胶质瘤细胞前端的突起可能与细胞的运动方向相关，并且Arp2/3参与胶质瘤细胞前端突起的形成。从上述发现中我们不难做出如下推测：首先，U251胶质瘤细胞前端突起与U251胶质瘤细胞运动密切相关；其次，沉默Arp2/3表达后U251胶质瘤细胞的运动能力可能会受到影响。

在迁移的细胞中，作为前端突起主要组成部分的片状伪足拥有大量的分枝状肌动蛋白丝，被认为是细胞的运动器官。在片状伪足中，Arp2/3能够调节已有的肌动蛋白丝从其侧面形成新的肌动蛋白丝，从而在片状伪足的形成中起到重要作用[15-17]。本研究通过transwell侵袭实验和划痕实验检测RNA干扰技术沉默Arp2/3表达后对细胞运动能力的影响。结果显示siRNA-Arp3组U251胶质瘤细胞运动能力明显受到抑制，提示Arp2/3复合物可能通过片状伪足的形成来影响胶质瘤细胞的侵袭与迁移，进一步验证了我们的推测。出现这种现象的可能存在机制为：①片状伪足作为细胞的动力器官，失去片状伪足后细胞无法获得运动所必需的动力；②片状伪足在局部粘着斑形成时的空间相关性方面起到重要作用。在缺乏片状伪足的情况下，局部粘着斑彼此之间难以对齐，从而影响细胞的迁移速度[18]。

基础研究领域的发现最终还应设法应用于临床。单凭提高手术技巧和采用目前的联合治疗方案，尽管一定程度上改善了病人的预后，但尚不能治愈恶性胶质瘤。恶性胶质瘤中的瘤细胞能分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)，它能促进内皮细胞增殖、迁移形成微血管，为胶质瘤细胞的侵袭、浸润提供必备条件[19]。贝伐单抗是一种单克隆抗体，它可以与血管内皮生长因子结合阻断其促进血管生成的作用。然而de Groot等[20]发现虽然贝伐单抗能够减少瘤内血管的数量，但会导致胶质瘤细胞沿着管周和软膜发生侵袭迁移，因此造成了贝伐单抗的应用并没有显著延长患者的总生存期。如果我们在采用原有联合治疗方案的基础上，一方面抑制恶性胶质瘤微血管生成切断肿瘤增殖所必需的养分供应，一方面抑制胶质瘤细胞的侵袭和迁移，这可能会对恶性胶质瘤的治疗起到事半功倍的效果。从本研究中我们发现Arp2/3复合物在胶质瘤细胞侵袭和迁移中发挥重要作用，我们相信Arp2/3复合物将成为今后有效治疗胶质瘤的一个重要靶点。

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