凝胶渗透色谱净化高效液相色谱-串联质谱法检测辛辣蔬菜中咪鲜胺等7种农药残留

丁葵英 高 彦 于金玲 孙 军 赵 晗 李 凯

（潍坊出入境检验检疫局 山东潍坊 261041）

1 前言

随着经济全球化进程加快，蔬菜中的农药残留问题已成为当今世界关注的焦点，特别是近年来农药残留事件时有发生，许多国家都对多种农药残留设定了严格的限量标准。咪鲜胺、异菌脲、虫酰肼和噻螨酮是在蔬菜和水果中经常使用的保鲜剂、杀虫剂和杀螨剂，虽属于低毒农药，但因使用较广、残效期长，对环境和食品安全具有潜在危险[1-3]；涕灭威及其代谢物涕灭威亚砜和涕灭威砜都是毒性相对较大的农药，对生态环境中土壤和水体的污染较大，对人体健康具有不容忽视的危害[4]。这7种农药在出口大葱、姜、洋葱、蒜和蒜苔中均是必检项目。目前蔬菜中这7种农药残留的单独或与其他农药残留一起检测常见报道，虫酰肼的测定主要采用紫外检测高效液相色谱（HPLC）法，而涕灭威及其衍生化合物的检测主要是柱后衍生-荧光检测的高效液相色谱法[5]，咪鲜胺、异菌脲和其他物质一起测定的液相色谱法和液相色谱-串联质谱法也有报道[6-8]，但作为辛辣蔬菜中7种物质同时检测的液相色谱-串联质谱法还未见报道。

蔬菜基质较复杂，特别是辛辣蔬菜样品，富含硫基及多种杂原子，这类化合物一般方法无法驱除，极易影响结果的判定及定量[4]。因此，本研究采用凝胶渗透色谱结合分散固相萃取技术对样品进行净化，然后采用HPLC-MS/MS法对辛辣蔬菜中7种农药化合物实现了一针同时分析，12min内完成7种化合物的上机检测。方法净化效果较好，自动化程度较高，省时，定性、定量准确可靠，灵敏度高，结果满意。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 试剂

甲醇、乙腈、环己烷：色谱纯，美国Fisher公司；乙酸乙酯：色谱纯，德国Merk公司；甲酸：色谱纯，美国Tedia公司；无水硫酸镁：分析纯，天津市光复精细化工研究所，使用前在500℃马弗炉内烘5h，200℃时取出冷却备用；中性氧化铝：上海五四化学试剂有限公司；石墨炭黑粉（GCB）、C18、PSA粉和氨丙基粉（NH2）：均购于Agela technologies inc公司；噻螨酮、虫酰肼、异菌脲、涕灭威砜、涕灭威、涕灭威亚砜和咪鲜胺标准品：纯度均大于≥97%，美国Sigma-Aldrich Laborchemikalien Gmbh 公司或德国Dr.Ehrenstorfer公司。

2.1.2 仪器

Agilent6430液相色谱-串联质谱仪：美国Agilent公司，配有电喷雾离子源；Accuprep GPC凝胶渗透色谱仪：美国J2公司，配有固定波长264nm紫外检测器；Bio-Beads SX-3净化柱：30mm×210 mm，填装23g填料，介质是中性、多孔的聚苯乙烯-二乙烯基苯微球体，排斥极限为相对分子量400-14000；Agilent ZORBAX SB-C18柱：2.1mm×100mm，1.8μm；Mettler AE163天平：感量为0.1g和0.0001g；5810R冷冻离心机：德国Eppendof公司；氮吹仪：N-eovap111；WD9000微波炉：格兰仕；涡流混匀器、T25均质器：IKA；0.45μm针头过滤器；GM 200碾磨仪。

2.2 方法

2.2.1 标准储备液的配制

标准储备液：准确称取10mg（精确至0.1mg）虫酰肼、噻螨酮、涕灭威砜、涕灭威亚砜、涕灭威、咪鲜胺和异菌脲标准品，分别置于100mL容量瓶中，用乙腈溶解，准确定容至100mL。标准储备液浓度100μg/mL，存储期6个月。

混合标准中间液：分别移取上述各标准储备液于100mL容量瓶，用乙腈准确定容，得混合标准中间工作液。混合标准液中咪鲜胺和虫酰肼的浓度为1.0μg /mL，噻螨酮、涕灭威砜、涕灭威亚砜、涕灭威和异菌脲的浓度为4.0 μg/mL；同上法，配制各标准品浓度为1.0μg/mL的单标液。0℃以下避光保存，有效期3个月。

混合标准工作液：分别移取混合中间工作液0.025、0.05、0.1、0.5、1和5mL于10mL容量瓶中，用流动相准确定容，得到混合标准工作液，用于绘制标准工作曲线（现用现配）。其中，虫酰肼和咪鲜胺的浓度为0.025、0.005、0.01、0.05、0.1和0.5 μg/mL，噻螨酮、涕灭威砜、涕灭威亚砜、涕灭威和异菌脲的浓度为0.01、0.02、0.04、0.2、0.4和2.0μg/mL。

2.2.2 样品提取

借鉴国内外较为严格的制样方法，根据不同基质采用不同的制样方法：大葱和蒜苔切段、洋葱撕成小碎片、大蒜去皮，低温下保存待用。实验时取出部分有代表性的样品，缩分不少于500g试样，装入清洁容器内，加封后标明标记。准确称取15.00g（精确到0.01g）样品，微波消解后，加入3g无水硫酸镁，然后加入15mL乙腈，于均质机上15000r/min高速均质2min，10000r/min离心10min。

2.2.3 样品净化

准确移取8m L上述提取液，氮气吹干，以8.0mL乙酸乙酯+环已烷（1+1）混合溶液溶解后上凝胶渗透色谱仪。乙酸乙酯+环已烷（1+1）混合溶液作为流动相，流速4.7 mL/min；样品进样量5.0 mL；收集6-12 min时流出的组分于100mL旋转瓶中40℃旋转蒸发浓缩至干；然后加入2mL乙腈溶解残渣，过100gPSA和50gNH2粉，涡混1min后静止；准确取1mL上清液氮吹，加 1mL初始流动相复溶，过0.2μm过滤膜，上机测定。

2.2.4 LC-MS/MS条件

2.2.4.1 LC条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱；柱温：40℃；进样体积：5 μL；流速：300 μL/min，共运行12min；流动相梯度洗脱条件见表1。

表1 ESI+电离模式下液相色谱梯度洗脱条件

2.2.4.2 MS/MS条件

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子(ESI+)模式扫描；检测方式：多反应监测(MRM)方式扫描；毛细管电压：电喷雾电压4500v；干燥器(N2)流速为：10 L/min；温度：300 ℃。其他参数见表2。

表2 7种化合物的液相色谱-质谱条件

3 结果与讨论

3.1 色谱和质谱条件的选择

3.1.1 色谱柱的选择

鉴于分离组分较多，且多种物质分子结构和性质相似，首先选择色谱柱对目标化合物进行有效分离。对比了Agilent ZORBAX SB-C18柱(2.1 mm×100mm，1.8μm)（柱1）、Agilent ZORBAX SB-C18柱(2.1 mm×50mm，1.8μm)（柱2）和Waters A CQUITY BEH C18(2.1 mm×100mm，1.7μm)（柱3）3种柱的分离效果。结果表明：柱1和柱3优于柱2，长柱分离效果远高于短柱，特别是对于咪鲜胺、异菌脲和虫酰肼 3种化合物，长柱能明显分离，而短柱则不能有效分离，这是由于在柱填料粒径相同的情况下，柱子越长，分离效果越好。在粒径相近的情况下，柱1与质谱仪结合能达到更高的灵敏度，因此选择柱1作为本研究的分离柱。

3.1.2 质谱条件的选择

3.1.2.1 母离子的选择

将各农药配成浓度为1.0μg/mL的单标，根据各化合物分子的分子结构和化学电离性质，分别选用电喷雾（ESI+）离子源，通过直接进样法，在优化质谱参数的基础上，对各化合物进行母离子全扫描，获得灵敏度较高的涕灭威、涕灭威砜、涕灭威亚砜、虫酰肼、噻螨酮、扑海因和咪鲜胺的M+H的离子分别为213.1、223.2、207.0、353.1、353.0、330.0和378.0。

3.1.2.2 其他质谱参数的选择

在确定各种农药的母离子后，参考相关文献，采用子离子扫描方式对子离子及碰撞能量进行优化选择。随着碰撞能量的不断增加，选择能产生最高丰度子离子的碰撞能量作为CID最佳碰撞电压。离子源温度：300℃；载气温度：300℃；载气流量：8L/min；喷雾压力：30psi；毛细管电压：4000V；光电倍增器电压增值：400v；扫面范围：50-400；检测方式：MRM。

7种农药残留的其他质谱分析参数见表2。7中农药标准品多反应监测（MRM）色谱图见图1，图中1、2、3、4、5、6和7分别为涕灭威亚砜、涕灭威砜、涕灭威、咪鲜胺、异菌脲、虫酰肼和噻螨酮的色谱峰。

图1 7种农药总离子流色谱图

3.2 提取溶剂的选择

提取试剂的选择与待测农药的性质、检测方法及样品的种类和性质形态有很大关系。依据相似相溶原理，从试样种类、待测农药特性和提取溶剂性质3方面综合考虑，以确定选用提取溶剂的原则。本研究的基质为辛辣蔬菜样品，大多属高水分含量样品基质，这决定本研究需采用中等极性和极性较强的有机溶剂提取。分别选用乙腈、乙酸乙酯作为提取溶剂，在同一添加水平，相同实验条件下，对所选样品进行回收率实验。实验结果表明：乙腈对所有成分的回收率都较好，而乙酸乙酯对涕灭威、虫酰肼、咪鲜胺的回收率远不及乙腈高。综合考虑各方面原因，最终选择纯乙腈作为提取溶剂。

3.3 净化方法的建立

3.3.1 凝胶渗透色谱净化方法的建立

本研究目标化合物在264nm（凝胶渗透色谱仪自带固定波长紫外检测器）皆有紫外吸收，分子量在200-400之间，其中分子量最小为涕灭威亚砜207和最大咪鲜胺378，所以选择咪鲜胺的出峰时间为开始收集时间，涕灭威亚砜出峰结束的时间为收集结束的时间，此时间段可将所有目标化合物收集。为保证收集时间的准确性，将10mg/mL农药的标准品8mL吹干后，用8mLGPC流动相（乙酸乙酯：环己烷体积比1:1）复溶，过GPC，其皆在6min之后开始有紫外吸收，而在14min已没有紫外吸收，故确定6-14min为收集时间。

3.3.2 凝胶渗透色谱净化效果的研究

为考察凝胶渗透色谱的净化效果，选定m/z在200-1000之间范围内蒜苔提取液进行离子全扫描，全扫描的质谱参数见表2，GPC净化前后的全扫描图分别见图2和图3。由图2、图3可看出m/z为 722.55、743.63、764.06、864.74、1043.77、1069.13、1152.99、1224.32的等主要杂质峰过GPC后几乎被完全去除掉。

图2 GPC净化前蒜苔提取液的全扫描图

图3 GPC净化后蒜苔提取液的全扫描图

3.3.3 QuEChERS技术对样品净化的研究

目前分散固相萃取常用的吸附剂主要有C18、NH2、GCB和PSA等几种，PSA粉可在一定程度上除去基质中的极性干扰物有机酸、糖以及某些极性较强的色素；C18和GCB除维生素、色素、甾醇的能力较好，NH2粉的离子交换能力较PSA弱，可根据需要选用[9]。为考察吸附剂吸附效果，将2 mL一定浓度乙腈溶解的农药混标溶液分别加入50、100和150 mg不同的吸附剂，经振荡、离心后，取上清液1mL，氮吹，流动相定容，过0.2μm滤膜上机，计算回收率来考察吸附剂对农药标准吸附情况，数据见表3。

表3 不同吸附剂处理后7种农药的回收率

由表3可知： C18和GCB对4种标准品有比较明显的吸附，而NH2粉对噻螨酮有明显的吸附，PSA对所有标准品都没有明显吸附。由于在样品提取液中目标物与杂质共存，并且杂质的含量要远高于目标物，在加入吸附剂后，吸附就存在着一定的优先和选择性，因此在实际样品检测中，吸附剂对目标物的吸附与在纯乙腈体系应有所不同，甚至相差较大。为证明此问题，以蒜苔为基质，乙腈提取，配制扑海因、咪鲜胺、虫酰肼和噻螨酮、涕灭威的基质标准，过PSA和NH2粉，考察其回收率。由表4可看出，加入样品基质后，粉末对标准品的吸附大大减少，其回收率大大增高，所以本研究选择50mgPSA和100mgNH2粉作为净化吸附剂。

表4 不同吸附剂处理后4种农药的回收率

3.3.4 吸附剂净化效果的研究

根据分散固相萃取的原理是通过吸附粉末的吸附作用达到净化的效果，此种净化方法主要去除的是极性中小分子。图4和图5分别是蒜苔样品经凝胶渗透色谱净化后，PSA和NH2粉吸附净化前后的全扫描图，从两图的比较可以看出，吸附剂对杂质有着非常强烈的吸附作用，过粉后图中主要的小分子杂质峰大大降低。

图4 粉末吸附净化前的蒜苔样品全扫描图

图5 粉末吸附净化后的蒜苔样品全扫描图

3.4 校正曲线、线性范围和定量限

将2.2.1节中工作液配制系列浓度的标准工作液按2.2.4的LC-MS/MS的色谱条件上机测定。各种农药定量离子5次测定的平均峰面积y对质量浓度x（μg/mL）进行线性回归，绘制标准曲线，得到线性回归方程、相关系数、线性范围，结果见表5。从表5数据可看出，r2均大于0.99，表明在一定质量浓度范围内7种农药的线性关系均良好，且可以较好的克服样品提取、净化及上机测定过程造成的误差。

用蒜苔空白样品作为基质添加不同量的农药标准品后按“2.2.2和2.2.3”节所述方法处理后测定，定量限（LOQ）根据10倍信噪比，检测限（LOD）根据3倍信噪比计算得出，结果见表5。由表5可知，该方法的LOQ均低于日本、欧盟等发达国家规定的目标农药残留限量（MRL），能满足日常检测的需求。

表5 种农药的线性方程、相关系数、线性范围、检测限和定量限

3.5 方法的准确度和精密度

在阴性蒜苔、大葱、洋葱和大蒜样品中的定量限添加水平下，按上述提取、净化和检测步骤，做15个平行性实验，计算各种农药的平均回收率和相对标准偏差（RSD），以考察不同基质中方法的准确度和精密度，其平均回收率均在70-110%之间，RSD均小于5%，说明运用本研究建立方法得到的数据是准确可靠。

此外，对本地市场销售和各公司报检的大葱、蒜苔、大蒜和洋葱抽取20份样品进行检测，检出涕灭威亚砜和咪鲜胺4份，并且在这4份样品中，涕灭威亚砜和咪鲜胺的检出值皆在其线性浓度范围之间。

4 结论

本研究建立了辛辣蔬菜中常见7种农药的凝胶渗透色谱结合分散固相萃取法净化，高效液相色谱串联质谱法检测的方法。其中GPC净化除去蔬菜中大部分大分子杂质，达到将杂质和目标组分分离的目的；分散固相萃取法作进一步净化，混合PSA和NH2粉可很好的吸附蔬菜中的色素、有机酸等小分子化合物。该方法具有灵敏度高、自动化程度高、重现性好、净化效果好等特点，适合多组分农药残留的定量检测与定性确证，能够满足包括欧盟、日本等国家和地区对于蔬菜中农药残留限量的要求。

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