春季海南岛近岸海域尿素与浮游生物的脲酶活性

黄凯旋，张 云，欧林坚，* ，吕颂辉，吕淑果，齐雨藻

(1.暨南大学赤潮与海洋生物学研究中心，水体富营养化与赤潮防治广东普通高校重点实验室(暨南大学)，广州 510632;2.海南省环境科学研究院，海口 570206)

过去的几十年间，作为一种重要的氮肥，尿素的使用量在全球范围内增加了100倍，中国和印度作为农业大国，尿素的使用量占到全球的一半［1］。由于尿素的过量使用，大量未被利用的尿素通过径流等方式进入沿海海域，从而导致近岸和河口水体中尿素含量大幅度升高［1-3］。尿素作为一种小分子有机氮源，可以被浮游植物直接吸收利用，在海洋氮循环中可能发挥重要作用［1，4］。然而，在很长的一段时间内，包括尿素在内的有机氮源对海洋初级生产力的贡献都被忽视了。水体中浮游植物对尿素的吸收率范围为0.1—3.6μmolN/h，有可能高于对无机氮的吸收率，占浮游植物对氮吸收的50%以上［5］。海区中尿素浓度较低，大洋中尿素浓度通常检测到的浓度为摩尔浓度，而近岸、河口和河流中尿素浓度变化极大，范围为0.02—23.40μmolN/L［1］。尿素并非海洋调查中的常规监测项目，目前对于全球(包括我国)大多数海区中尿素浓度的分布及生物可利用状况知之甚少。

在浮游植物细胞内，尿素主要通过脲酶作用水解为NH+4和CO2，随后进入各种生化代谢途径［6］。有研究表明，不同种类的浮游植物在利用尿素的能力上存在差异，海水中尿素浓度的增加可能有利于某些类群的生长，如蓝细菌、甲藻等［7-8］。越来越多的研究发现尿素的输入与有害藻华的发生存在一定的相关性［9-10］。近岸和河口水域尿素的可利用性及其对浮游生物群落的影响已成为新的研究热点［11-12］。

海南省位于我国最南端的南海海域，海水洁净，总体水质良好。但近年来，随着海南经济的发展，大量工农业废水和生活污水直接或间接排入海洋，导致近岸海区富营养化程度加剧，有害藻华频发，且规模不断扩大［13-14］。赤潮多发生在2—5月间，海口、澄迈、文昌、陵水和三亚沿海一带海域是海南赤潮监控的重点区域［15］。2011年春季(4—5月)，研究者对上述5个区域开展调查采样，重点研究水体中的尿素浓度及浮游生物的脲酶活性的水平分布状况，结合相关的理化环境数据，分析海南岛近岸海域尿素的可利用性及其对浮游植物种群生长、种间竞争可能产生的影响，为研判该海域海水的污染程度及赤潮的发生机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 站位布设与采样时间

调查区域包括5个海湾，分别为位于北部的海口湾(5个测站)和澄迈湾(6个测站)，位于东部的文昌八门湾(8个测站)，位于南部的陵水新村湾(6个测站)、大东海(6个测站)(图1)。海口湾位于海口市北部，海湾面积43.7km2，海口市生活污水以及部分工业废水由龙昆沟和秀英沟排污口直接或间接排入海域，并有来自海口新港和海甸溪入海口等的污染物，海口湾近岸海域富营养化程度高。澄迈湾为澄迈县北部海湾，海湾面积16km2，澄迈湾近岸拥有万吨深水泊位码头，并有大量重工业落户于马村港，澄迈湾面临着很大的环境压力，部分水体出现富营养化。文昌八门湾位于海南省东部，铜鼓岭淇水湾海域分布数千亩养虾池，为海南省重要的养殖基地。位于南部的陵水新村湾为天然泻湖性港湾，西部有一窄口与陵水湾想通，集渔港、海水养殖、滨海旅游和居住区为一体。大东海地处海南省最南端，近年来随着旅游业的兴起和养殖业的不断扩大，沿海一带的的水质呈现轻度污染状态。澄迈湾、陵水新村湾和文昌八门湾的采样时间为2011年4月26日，海口湾为2011年4月29日，大东海为2011年5月25日。

1.2 调查项目及方法

水温和盐度由美国YSI 6600V2现场监测。总溶解态氮(TDN)、硝酸盐()+亚硝酸盐()、总溶解态磷(TDP)和磷酸盐(DIP)浓度采用荷兰Skalar San++连续流动分析仪测定。铵盐()按照《海洋调查规范》［16］测定。溶解无机氮(DIN)=++，溶解有机氮(DON)=TDN-DIN，溶解有机磷(DOP)=TDP-DIP。

浮游植物的采集、固定和计数均按《海洋调查规范》［16］执行，在日本Olympus BX61光学显微镜下进行浮游植物种类的鉴定和定量计数。

尿素含量的测定仿照Revilla等［8］的方法。现场海水经煅烧过的GF/F膜(450℃，3 hr)过滤，冻存。样品检测时，取水样各4 mL分装入4个检测试管中，其中2只各加入1.2 mL显色试剂，另2只各加入1.2 mL空白对照试剂。(22±2)℃的黑暗环境下涡旋振荡72 hr，在韩国Mecasys Optizen 2120UV分光光度计520 nm波段下检测。所得尿素含量以μmol/L表示。

脲酶活性的测定以Solomon等［6］的方法为基础进行优化。浮游植物颗粒经100μm孔径筛绢过滤后，采用GF/F滤膜收集，液氮中保存。在滤膜样品上加入1 mL匀浆抽提液，冰浴条件下破碎研磨细胞，离心后取上清液分别转移至检测试管tf及对照管t0中，加入脲酶反应缓冲液。在tf管中加入尿素储备液(N终浓度为5 mmol/L)，20℃水浴下反应1 h，对照组t0管在水浴反应前既沸水灭活处理。待样品冷却至室温后，加入苯酚溶液，按照NH+4的方法在韩国Optizen 2120UV分光光度计640 nm波长下检测样品。脲酶活性以μmolN·L-1·h-1表示。

图1 海南岛监测区域与测站位布设Fig．1 Monitoring areas and stations in Hainan Island

1.3 数据分析处理

使用SPSS17.0软件进行数据统计分析:1)不同海湾间同一理化环境参数的差异性采用单因素方差分析方法(ANOVA);2)理化环境参数对浮游生物脲酶活性和浮游植物细胞密度的影响，采用stepwise回归相关性分析法，其中北部海区甲藻细胞密度与各参数的stepwise分析无法建立回归方程，进而采用Enter回归分析法;3)对不同理化环境因子进行主成分分析，并对5个海湾不同理化参数进行聚类分析。

2 结果

2.1 不同海湾理化环境因子的变化

海南岛北部近岸海域(海口湾、澄迈湾)水温显著低于南部海域(陵水新村湾、大东海)(P＜0.01)(表1)。各海湾盐度范围32.6—34.0，无明显差异(P＞0.05)。DIN表现出由南向北递增，除个别海湾站位外，硝酸盐含量占DIN含量的90%以上。海口湾富营养化最为严重，其DIN、DIP含量明显高于其它海湾(P＜0.05)。各海湾海水的营养盐组成与结构存在区别。海口湾和大东海水体中的DIP含量较高，达到二、三类标准，大东海部分海区呈无机磷污染，该海区平均DIN/DIP为6，可能存在氮限制。在澄迈湾和文昌八门湾，绝大多数测站的DIP均低于检出水平，有机磷源占据主要成分，达52%以上，海区存在潜在的磷胁迫或限制。

对不同理化环境因子进行主成分分析，提取到5个主成分累计贡献率为79.58%。5个主成分分别为DIN、DOP、DON、浮游植物细胞密度和盐度，可见除外无机氮外，有机氮和有机磷浓度是海南省近岸海域较为重要的营养盐指标。5个海湾的聚类分析表明，文昌八门湾和陵水新村湾的理化环境因子状况相似程度最为接近，这可能与文昌八门湾和陵水新村湾同为海南省重要的养殖基地有关。

表1 春季海南岛近岸海域不同海湾环境理化因子比较Table 1 The comparison of physical and chemical factors of different areas in the coastal waters of Hainan Island during spring

2.2 不同海湾尿素浓度分布及其对氮源与浮游植物生长的贡献

海南岛近岸海域中尿素浓度平均值范围为2.07—3.30μmol/L，占TDN含量的14%—38%，且尿素占TDN比例由北向东南方向升高(表2)。如图2所示，各海湾较高水平的尿素浓度主要分布在排污口、养殖区或旅游区的近岸海域。尿素浓度较高的水体中发现甲藻细胞密度达到104—105个/L的水平，细胞密度高于一般水体。

表2 春季海南岛近岸海域不同海湾尿素浓度、脲酶活性与浮游植物丰度比较Table 2 The comparison of urea concentrations，urease activities and phytoplankton densities in different areas in the coastal waters of Hainan Island during spring

澄迈湾尿素平均浓度及占TDN比例均低于其它海湾，2号测站马村港出海口的尿素浓度最高，为6.16 μmol/L，在该站测站的甲藻细胞密度也最高，达1.65×104个/L。海口湾尿素平均浓度高于其它海湾。7号测站海甸溪至8号测站龙昆沟入海口近岸海域尿素浓度较高，其中龙昆沟浮游植物细胞密度高达18.32×106个/L，同时发现甲藻细胞密度达到1.20×104个/L，其它站点的甲藻数量非常少。文昌八门湾尿素占TDN含量的11—38%，13号测站清澜港通航水道和淇水湾近岸海域尿素浓度较高，范围为3.23—3.34μmolN/L，甲藻细胞密度范围为104—105个/L。陵水新村湾尿素浓度变化范围0.62—5.28μmolN/L，其中新村湾养殖网箱附近的21号测站和24号测站出海口外尿素浓度最高。21号测站尿素浓度甚至高于硝酸盐，占TDN含量49%，在该站，检测到锥状斯氏藻(Scrippsiella trochoidea(Stein)Loeblich)密度达到104个/L，其它测站甲藻数量少。大东海尿素和NO-3平均浓度均为2.24μmolN/L，多个测站的尿素浓度高于硝酸盐，尿素占TDN的比重高于其它海湾，大东海海域甲藻种类最多且平均密度也高于其它海湾。在26、27测站，尿素浓度占TDN的30%以上，这2个测站出现的甲藻种类较多，密度达到104—105个/L。

2.3 不同海湾浮游生物脲酶活性分析

春季，海南岛浮游生物脲酶活性为0.30—0.84μmolN·L-1·h-1，海口湾最高，从北部向东、南部逐渐减少(表2，图3)。在澄迈湾，3号测站东水港出海口脲酶活性较高，达到0.76μmol·L-1·h-1。海口湾龙昆沟出海口脲酶活性最高，达1.63μmolN·L-1·h-1。龙昆沟为海口市生活污水的排污口，近岸水体污染严重，无机营养盐及尿素含量均为高值，浮游植物包括甲藻细胞密度均为海口湾最高。文昌八门湾脲酶活性最高点出现在13号测站，达0.86μmolN·L-1·h-1，13号站不仅尿素浓度较高，DOP浓度为该湾最高值，达0.78μmol/L。新村湾脲酶活性和浮游植物细胞密度均高于陵水湾，脲酶活性与细胞密度相关性显著(R2=0.82，P＜0.05)。新村湾养殖区水域的脲酶活性最高，21号测站TDP浓度、浮游植物包括甲藻细胞密度均为陵水新村湾最高。大东海红沙湾附近水域脲酶活性范围为0.54—1.16μmolN·L-1·h-1，其中30号测站尿素和DIP浓度高，DIP浓度达0.67μmol/L。

理化环境参数对海南省浮游生物脲酶活性的回归分析显示，海南省浮游生物脲酶活性和细胞密度、盐度和DIN的相关性显著(R2=0.97，P＜0.01)，5个海湾的脲酶活性97%的变化由细胞密度、盐度和DIN引起。北部海区(海口湾和澄迈湾)脲酶活性94%的变化由浮游植物细胞密度决定，两者的相关性极其显著(R2=0.94，P＜0.01)。在南部海区(陵水新村湾和大东海)，盐度和DOP浓度可解释77%的脲酶活性变化(R2=0.77，P＜0.05)。浮游生物脲酶活性的分布与尿素的情况类似，在排污口、养殖区或旅游区的近岸海域，脲酶活性水平较高，这些水体的氮、磷浓度或细胞密度的水平也较高。

图3 春季海南近岸海域脲酶活性(μmol·L-1·h-1)分布图Fig．3 The distribution of urease activities in different areas in the coastal waters of Hainan Island during spring U:低于检测限

2.4 浮游植物生长分布与海区理化因子的相关性分析

海南岛近岸海域浮游植物群落以硅藻为优势种，各海湾浮游植物平均细胞密度达到106个/L以上。文昌八门湾18号测站和陵水新村湾水体以拟菱形藻(Pseudo-nitzschia spp.)为优势种，细胞密度达到106—108个/L;其它海湾的优势种主要为骨条藻(Skeletonema spp.)和短角弯角藻(Eucampia zodiacus)。春季甲藻种类少细胞密度低，密度为104—105个/L的水体中其尿素和脲酶活性也处于较高水平。尿素可能在一定程度上促进近岸海域甲藻的生长，对浮游植物种群结构的变化存在影响。如表3所示，该海区浮游植物细胞密度主要由脲酶活性或尿素占TDN比例所决定，北部海湾甲藻细胞密度也主要受脲酶活性的影响。DON与甲藻细胞密度相关性显著，对海南岛甲藻的生长繁殖的作用较为重要。由此可见，海南浮游植物包括北部的甲藻可能更多的受到脲酶，进而是尿素的影响，南部甲藻则主要受到和DON的影响。

表3 春季海南近岸海域浮游植物细胞密度与相关理化因子的多元线性回归分析Table 3 The regression analysis of phytoplankton densities and the relevant environmental factors in the coastal waters of Hainan Island during spring

3 讨论

不同种类的浮游植物在利用尿素的能力上存在差异，甲藻单位细胞内的脲酶活性高于硅藻等其它种类。海区中尿素浓度的升高，不仅为浮游植物提供了更多的氮源，刺激初级生产力，还可能有利于鞭毛藻(包括甲藻)而非硅藻的生长，浮游植物的种群结构因此发生改变，从而引发种群的演替［1，12］。硅藻细胞的大量繁殖与水体中含量成正相关性，而鞭毛藻(包括甲藻)更适应低N，高 N、尿素和 DON 的环境［19，21］。在文昌八门湾出现高密度拟菱形藻的水体中，所测脲酶活性较低，可能与拟菱形藻吸收利用尿素的能力和细胞内的脲酶活性不高有关。海南春季以硅藻为优势种，相对于硅藻，甲藻种类少细胞密度低，有些海区监测不到甲藻，而在甲藻细胞密度达到104—105个/L水平的水体中发现其尿素和脲酶活性均处于较高水平。大东海硝酸盐浓度较低，部分海区尿素浓度高于硝酸盐，尿素占TDN的比重高于其它海湾。在大东海海域的水体发现，甲藻种类最多且平均密度高于其它海湾。多元回归分析表明，海南岛DON对甲藻细胞密度有着较为重要的影响，北部海湾甲藻生长可能主要受到尿素的影响，而南部甲藻细胞密度则与N和DON关性显著。

4 结语

2011年春季，对海南岛的海口湾、澄迈湾、文昌八门湾、陵水新村湾和大东海5个海湾开展调查研究，得出以下结论:1)海南岛近岸水体中以硝酸盐为主要氮源，尿素平均浓度为2.07—3.30μmolN/L，高于NH+4浓度，占TDN含量的14%—38%，尿素占TDN比例由北向东、南方向加重递增。2)浮游生物脲酶活性为0.30—0.84μmolN·L-1·h-1，海口湾最高，从北部向东、南部逐渐减少。各海湾较高水平的尿素和脲酶活性主要分在排污口、养殖区或旅游区的近岸海域。3)海南春季以硅藻为优势种，甲藻种类少且细胞密度低，部分甲藻细胞密度达到104—105个/L的水体，尿素和脲酶活性也处于较高水平。尿素在一定程度上促进春季海南岛近岸海域甲藻等浮游植物的生长，可能对浮游植物群落结构的改变产生重要影响。

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