三磷酸腺苷二钠氯化钠注射液的质量控制及安全性研究＊

陈琴华，李 鹏，朱 军

(湖北医药学院附属东风医院药学部·药物分析与筛选研究所，湖北 十堰 442008)

三磷酸腺苷(ATP)是一种具有多种重要生理活性的辅酶，参与蛋白质、脂肪、糖、磷脂及核酸的合成与代谢，适用于因细胞损伤后细胞酶功能减退引起的疾病，临床上主要用于心律失常、心力衰竭、心肌炎的治疗[1]，以及脑出血后遗症和肝炎疾病的辅助治疗[2－3]。目前市场上供注射用的ATP剂型为水针和粉针，海南新隆药业有限公司联合江西科伦药业有限公司解决了ATP不稳定的工艺难题[4]，首次研究申报了大容量氯化钠注射液，减少了药物配液交叉污染的机会，提高了该药的临床应用水平。现对ATP氯化钠注射液的质量可控性和制剂安全性进行了探讨，报道如下。

1 试验材料

高效液相色谱仪，包括SPD－10A检测器、LC－10AT泵(日本岛津公司);pHs－25型酸度计。ATP对照品(含量大于99.5%);ATP氯化钠注射液(规格为 100 mL∶20 mg，批号为050601，050602，050603，江西科伦药业有限公司);甲醇(色谱纯)，其他试剂(分析纯)。豚鼠，雄性，体重250～350 g;家兔，雌雄不限，体重2.0～2.5 kg;均由中国医科大学第二临床学院实验动物中心提供，动物许可证号SCXK辽2003－2009。

2 方法与结果

2.1 质量控制

2.1.1 总核苷酸测定

精密量取本品5mL，置50mL容量瓶中，加0.1mol/L磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钠35.8 g，加水至1 000mL，无水磷酸二氢钾13.6 g，加水至 1 000mL，调节 pH 至 7.0)至刻度，振摇使混匀。以上述缓冲液为空白溶液，照分光光度法测定，在259 nm波长处测定吸光度，按ATP的百分吸收系数为279，计算总核苷酸含量。

2.1.2 ATP 的重量比

色谱柱为 Kromasil C18柱(250 mm ×4.6 mm，5μm)，流动相为0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(磷酸氢二钠35.8 g，磷酸二氢钾13.6 g，加水900mL溶解，用氢氧化钠溶液调节pH为7.0，加入四丁基溴化铵 1.61 g，加水至 1000mL)－甲醇(95∶5)，柱温35℃，流速为1.0mL/min，检测波长为259 nm。在此色谱条件下理论板数按ATP峰计算应大于2 000，各色谱峰的分离度应大于1.5。按出峰次序依次记录一磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷的峰面积，高效液相色谱分析见图1。参照2010年版《中国药典(二部)》[5]方法计算ATP的重量比。ATP含量(%)=[总核苷酸×ATP的重量比(%)]/标示量，有关物质(%)=1－ATP的重量比(%)。

2.1.3 标准曲线制备

紫外分光光度法:精密称取ATP对照品20 mg，置100mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。精密吸取 0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL分别置10 mL容量瓶中，加0.1 mol/L磷酸盐缓冲液稀释至刻度，照分光光度法测定。结果表明，ATP质量浓度在12～28μg/mL范围内与吸光度具有良好的线性关系，回归方程为Y=0.032 2X －0.033 5，r=0.999 4(n=5)。

图1 ATP氯化钠注射液高效液相色谱图

高效液相色谱法:精密称取ATP对照品20mg，置10mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。精密吸取 0.2，0.6，1.0，1.4，1.8mL，分别置10mL容量瓶中，加水稀释至刻度。分别吸取20μL注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，ATP质量浓度在0.04～0.36 g/L范围内与峰面积具有良好的线性关系，回归方程为 Y=2×107X+2×104，r=0.999 6(n=5)。

2.1.4 回收率试验

精密称取16，20，24mg的ATP对照品各3份，分别加入处方量辅料，置100mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，依法测定。结果总核苷酸和ATP的重量比回收率(n=3)分别为 99.1%，100.8% 和 99.3% 。

2.1.5 精密度和稳定性试验

取同一份ATP氯化钠注射液，依法测定6次，测定总核苷酸和ATP重量比。结果含量和 RSD分别为102.8%和0.85%。于0，2，4，6，8，12 h 时依法测定同一份样品，结果表明样品在 12 h内稳定。

2.1.6 重复性试验

取ATP氯化钠注射液6份，依法测定总核苷酸和ATP重量比。结果含量和 RSD分别为102.8%和1.15%。

2.1.7 含量测定和有关物质

取本品3批样品，测定总核苷酸和ATP重量比，计算有关物质和标示含量。结果见表1。

表1 样品有关物质和含量测定结果(n=3)

2.2 安全性试验

2.2.1 过敏性试验

取健康豚鼠18只，体重250～350 g，随机平均分成3组，分别为生理盐水组、阳性对照组(10%鸡蛋清，生理盐水与鸡蛋清9∶1混合即成)和ATP氯化钠注射液组，各组每只动物隔日腹腔注射受试药物0.5mL，共3次。首次注射后的第14天和第21天，各组分别取3只豚鼠，每只分别给予对应的受试药物1.0mL进行攻击，观察过敏反应现象。阳性对照组豚鼠在注射后共有5只出现呼吸困难、喷嚏、干呕、咳嗽等过敏反应，给药组及阴性对照组两次攻击后均未见异常表现，结果均为阴性。

2.2.2 体外溶血试验

取兔血，离心、洗涤后，制备体积分数为2%的红细胞混悬液。取试管7支，分别加入2.5 mL红细胞混悬液，其中两支分别加入2.5mL蒸馏水和生理盐水，作为阳性对照和阴性对照，其他5 只试管中依次加入 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5mL 的 ATP 氯化钠注射液，各试管分别补加生理盐水至5 mL，摇匀，置37℃水浴保温，连续观察4 h。阳性对照管加入蒸馏水后，立即出现溶血现象;各供试药液管及阴性对照管未发生溶血现象，红细胞逐渐沉于管底，经振摇后可均匀散开，说明亦无红细胞凝聚现象。

2.2.3 血管刺激性试验

取家兔8只，分2组，每组4只，分别于耳缘静脉滴注ATP氯化钠注射液和0.9%氯化钠注射液，滴注量均为4mL/kg，滴速为1.0mL/min，每天1次，连续3 d，给药期间每日观察血管注射部位及整个外耳廓有无变化。于第3次给药后24 h将动物处死，取给药处血管及周边组织，以5%甲醛溶液固定、切片、染色，切片部位为进针部位向心端1 cm及2 cm处。给药组、0.9%氯化钠注射液对照组血管均未见异常病理改变，耳缘静脉内无血栓形成，血管内皮细胞及周围组织未见水肿、炎性浸润或坏死等异常改变。

3 讨论

含量和有关物质是衡量药物有效性和内在品质最重要的指标，一般来说，越接近标示含量，有关物质越少，则药物的品质越高。ATP化学结构不稳定，高温和长期存放时容易分解成二磷酸腺苷(ADP)和一磷酸腺苷(AMP)，这两种物质不具有毒副作用，体内与ATP存在相互转化关系。但是，药品注册管理办法规定有关物质作为药品质量控制的指标，必须规定限度。中国药典标准和部颁生化药品标准对ATP原料和制剂有关物质未作要求，仅要求原料含量分别为大于95%和85%。曾依法测定了多个厂家上市的ATP水针制剂，有关物质均在10%左右。ATP氯化钠注射液采用精制高纯度原料，含量高，制剂有关物质低，确保了临床应用的有效性。

文中建立的质量控制方法，能控制ATP氯化钠注射液的质量。按照2010年版《中国药典(二部)》附录ⅠB注射剂项下有关要求，质量标准还增加鉴别、细菌内毒素和氯化钠含量测定等项目，以确保药品的安全有效。特殊安全性试验表明，ATP氯化钠注射液对受试豚鼠无致敏作用，对家兔红细胞无明显体外溶血和凝集作用，对家兔耳缘静脉亦无明显刺激性，符合临床安全性方面的要求。由此可见，ATP氯化钠注射液安全、有效、质量可控。

[1]运 锋，董宁程，向东韩，等.三磷酸腺苷治疗阵发性室上性心动过速的临床研究[J].临床急诊杂志，2004，5(3):4－6.

[2]易生禹，只达石.颅脑损伤诊治[M].北京:人民卫生出版社，2000:110－112.

[3]王 凯，汪素文.临床肝病治疗学[M].济南:山东大学出版社，2002:80－90.

[4]刘小清.三磷酸腺苷二钠氯化钠注射液及其制备方法.中国，03142254.3[P].2004 － 03 － 31.

[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:28－29.