应用小鼠早期胚胎活性因子诱导小鼠成纤维细胞再程序化为多能干细胞的实验研究

刘 婷，王立斌，朱永朝，金毅然，李玉奎，魏 军 (宁夏医科大学总医院宁夏人类干细胞研究所，宁夏 银川 750004)

体细胞再程序化的研究主要包括核移植技术、细胞融合技术、利用卵细胞和干细胞的活性因子诱导体细胞的再程序化、基因转导技术这四种技术［1］，但是现行几类再程序化技术均存在诱导效率低、遗传变异高或者依赖病毒转染，无法大批量应用。鉴于此，本研究希望能够建立一种新的应用小鼠早期胚胎活性因子的再程序化技术生成多能干细胞。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料:6～8周龄ICR小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 主要仪器及试剂:倒置显微镜、解剖显微镜(Olympus公司)，二氧化碳培养箱(Thermo公司)，PCR仪(Eppendorf公司)，胎牛血清、DMEM、胰蛋白酶、Trizol(Invitrogen公司)，M2培养液、M16培养液(Sigma)，反转录试剂盒(Fermentas公司)，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠成纤维细胞的获得与培养:取孕13 d的母鼠，在无菌条件下取出胎鼠，分离背部皮肤，将组织充分剪碎，加入0.125%的胰蛋白酶在4℃消化1 h后，用等量的含FBS的DMEM终止消化，吸取上清液离心。去上清，加培养液，吹打悬浮后以5×105/ml密度接种于培养瓶，在37℃、5%CO2的培养箱中培养。

1.3.2 小鼠体外受精:体外受精及早期胚胎的培养均采用微滴培养法，将受精卵培养至3.5 d囊胚，大量收集冻于-80℃冰箱。

1.3.3 小鼠早期胚胎蛋白的获得:将收集得到的小鼠3.5 d囊胚转移至含有蛋白酶抑制剂的裂解液中超声，12 000 rpm，4℃，离心15 min，取上清，测定蛋白浓度，冻于-80℃冰箱备用。

1.3.4 应用小鼠早期胚胎蛋白诱导小鼠成纤维细胞再程序化:将培养的小鼠成纤维细胞消化后，调整细胞浓度为2×105个/ml，做10～15个20 μl微滴，将之前制备的小鼠3.5 d囊胚蛋白10 μl加入到微滴内，隔天等量补充，待细胞增殖至90%密度后，常规传代培养扩增。

1.3.5 诱导后多能干细胞形态学观察:取诱导前后，不同阶段的细胞于倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态变化，采用MTT法测定P3代细胞生长曲线。

1.3.6 诱导后多能干细胞特异性基因表达鉴定:采用Trizol法抽提再程序化后小鼠多能干细胞总RNA，反转录，PCR测定多能干细胞特异性基因Oct 3/4(引物序列)，详见表1。

表1 引物序列

1.3.7 诱导后多能干细胞多向分化潜能鉴定:按本实验室已经建立的诱导分化体系［5］，将获得的小鼠多能干细胞诱导向脂肪细胞、成骨细胞分化，并鉴定。

2 结果

2.1 小鼠成纤维细胞与3.5 d囊胚的形态学特征:原代培养的小鼠成纤维细胞大约4～6 h贴壁，杂细胞较多，传代至第三代，细胞形态均一，为梭形或多边形，生长速度较快(见图1)。体外受精获得的胚胎各阶段发育良好(见图2)。

图2 体外受精不同阶段小鼠受精卵形态

2.2 再程序化后的小鼠多能干细胞的形态学观察与生长特性鉴定:加入小鼠3.5 d囊胚蛋白后，可以观察到小鼠成纤维细胞的胞质开始部分回缩成圆形，细胞核增大，细胞增殖加快(见图3)。MTT法测定第三代细胞的生长曲线，细胞传代后潜伏期约为24 h，然后细胞增殖速度加快，进入对数增殖期，72 h后生长速度减缓(见图4)。

图3 诱导再程序化后的小鼠多能干细胞形态

图4 MTT法测定P3代细胞生长曲线

2.3 再程序化后的小鼠多能干细胞的基因表达鉴定:电泳结果显示，再程序化后的多能干细胞表达干细胞特异性基因Oct3/4，并且这种特性不受细胞代次影响(见图5)。

图5 Oct 3/4基因表达鉴定

2.4 再程序化后的小鼠多能干细胞的多向分化潜能鉴定:在脂肪细胞定向分化条件下，细胞停止增殖，胞质增大，出现大量脂滴被油红O染色为红色(见图6A)。在成骨细胞诱导分化条件下，细胞大片聚集重叠生长，茜素红染色可见红色钙结节(见图6B)。

图6 再程序化后的小鼠多能干细胞向脂肪细胞、成骨细胞的诱导鉴定

3 讨论

目前体细胞再程序化技术均存在各种局限。核移植技术虽然已成功应用于多种动物的克隆和人的早期胚胎的培育，但是成功率低并能诱发较高的遗传变异。细胞融合技术虽然已成功应用于细胞再程序化机制的研究，但其生成正常细胞的效率过低而不能应用于临床干细胞的培育。基因转导技术已经先后成功培育出小鼠和人的多能干细胞［2-3］。并且，由此技术生成的多能干细胞已经成功用于地中海贫血症的模型动物的治疗。基因转导技术是目前体细胞再程序化研究领域最成功的技术。然而，由于这一技术依赖于利用病毒的基因转导，由此技术生成的多能干细胞因带有病毒这一潜在的不安全因素而不能应用于临床。最后是利用卵细胞和干细胞的活性因子诱导体细胞的再程序化，已经证明非洲爪蟾卵细胞和小鼠胚胎干细胞的蛋白内容物能够使体细胞转化成多能干细胞，但是这一技术尚未能培育出稳定的再程序化干细胞。

为了解决现有再程序化技术应用的局限，本研究提取小鼠早期胚胎总蛋白用于诱导成纤维细胞再程序化，初步确定得到的细胞能够长期增殖不分化，表达干细胞特异性基因Oct3/4，可以诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞。证明在早期胚胎中含有可使体细胞转化成多能干细胞的再程序化因子，可以不使用基因转导的方法生成稳定的多能干细胞。本研究如果能够进一步在人体细胞中得到证实，将有望获得无病毒转导，可用于临床的患者个体化和疾病特异性的多能干细胞。

［1］ Takahashi K，and Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors［J］.Cell，2006，126(4):663.

［2］ Libin Wang，Yinxue Yang，Yongzhao Zhu，et al.Characterization of placenta-derived mesenchymal stem cells cultured in autologous human cord blood serum［J］.Molecular Medicine Reports，2012，6(4):760.

［3］ Takahashi K，Tanabe K，Ohnuki M，et al.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors［J］.Cell，2007，131(5):861.