经空肠注入大承气汤对急性胰腺炎大鼠细胞因子和胰腺细胞凋亡的影响

田 明 丁治国 陈振宙 鲁香凤 王 广

1.北京中医药大学东直门医院普外科，北京 100700；2.北京中医药大学东直门医院病理科，北京 100700

大承气汤治疗急性胰腺炎的疗效已得到广大临床工作者的认同。研究证明大承气汤有促进肠蠕动、防止肠道细菌及毒素移位、控制全身炎症反应综合征、抑制促炎因子等作用[1]。细胞凋亡或者坏死是胰腺自身消化、微循环障碍、炎性介质等多个因素作用于胰腺细胞后产生的最终影响，被认为是急性胰腺炎发病机制的终末效应阶段[2]。如细胞以凋亡方式死亡，则不引起炎症反应及胰外脏器功能损害，而只出现轻型胰腺炎。目前，大承气汤对急性胰腺炎胰腺腺泡细胞凋亡的影响仍为空白。因急性胰腺炎可延缓胃排空，造成恶心、呕吐，经空肠给药可有效避免呕吐导致给药失败。本实验建立急性重症胰腺炎大鼠模型，观察空肠内注入大承气汤对急性胰腺炎大鼠细胞因子的影响和胰腺腺泡细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验动物雄性SD大鼠，数目90只，体重250～280 g。大承气汤（北京中医药大学东直门医院中药房提供），配方为大黄 12 g、枳实 12 g、厚朴 15 g、芒硝 9 g，煎为 200 mL。

1.2 实验分组

大鼠随机分为假手术组、模型组和治疗组，每组各30例。假手术组仅行开腹、经胃造口置空肠管术。模型组采用3.5%牛磺胆酸钠胰周注射法制造大鼠急性胰腺炎模型，假手术组和模型组术后2 h 一次性空肠内注入10 mL 生理盐水。治疗组在模型组基础上术后2 h 按10 mL/kg的剂量一次性空肠内注入大承气汤。

1.3 实验方法

大鼠术前空腹12 h，按分组标记后，称重。用10%水合氯醛（400 mg/kg 体重）腹腔注射麻醉，开腹。假手术组大鼠：开腹后，行胃造瘘术，然后经胃造口置入内径1.0 mm硅胶管于空肠上段2.0cm处，关腹。模型组及治疗组大鼠：开腹后，用1 mL 注射器向胰周被膜内匀速注射3.5%牛磺胆酸钠约1 mL，使整个胰腺均匀隆起。然后经胃造口置入内径1.0 mm 硅胶管于空肠上段2.0cm处。检查无消化道漏，关腹。各组大鼠术后10～15 min 清醒后限制饮水，笼中自由活动。术后2 h，治疗组按10 mL/kg的剂量经造瘘硅胶管一次性空肠内注入大承气汤，假手术组和模型组经造瘘硅胶管一次性空肠内注入相应体积的生理盐水。给药24 h后开腹，腹主动脉取血1 mL，于4℃下离心10 min，转速1 500 r/min。取上清，分装冻存于-80℃冰箱。切取胰腺标本，置20%中性磷酸盐缓冲液-甲醛中固定，送组织病理检查。

1.4 检测方法

1.4.1 检测项目及方法 大鼠血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素 1β（IL-1β）、白介素 18（IL-18）集中采用 ELISA 法检测 TNF-α、IL-1β、IL-18 浓度变化。

1.4.2 胰腺炎组织损伤病理评分标准 胰腺组织病理学积分采用改良Grewal 法[3]对胰腺炎组织损伤进行定量评估，病理评分标准如下。①水肿：0分，无水肿；1分，胰腺小叶间隙增宽；2分，重度叶间隙增宽；3分，腺泡间隙增宽；4分，细胞间隙增宽。②炎症：以每个高倍视野（HPF）中的炎性细胞数计算，每5个炎细胞计0.5分，超过30个计4分。③出血：以每个 HPF 计算，0分，无出血；1分，1～2个出血点；2分，3～4 个出血点；3 分，5～6 个出血点；4 分，7～8个或更多出血点。④坏死程度：以每个HPF 计坏死细胞数，0分，1～4个/HPF；1 分，5～8 个/HPF；2 分，9～12 个/HPF；3 分，13～16 个/HPF；4分，17个以上或广泛融合的坏死。连续观察8～10个视野，根据各个视野的水肿、炎症、出血和坏死各类积分分别计算均数；各均数相加得每只大鼠的病理积分总分。

1.4.3 计算胰腺腺泡细胞凋亡指数 每个大鼠的胰腺石蜡标本块取8个切片，每张切片选取8个阳性细胞数最多的高倍视野，每个视野计数100个细胞和其中的凋亡细胞，计算800个腺泡细胞中阳性细胞所占的百分比作为每只大鼠胰腺组织的凋亡指数，凋亡指数=阳性细胞数/800×100%。

1.5 统计学方法

应用SPSS 11.0版统计软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，采用方差分析，两两比较应用SNK-q检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 死亡情况

模型组死亡3例，治疗组死亡2例，两组差异无统计学意义。假手术组大鼠无死亡。

2.2 外周血细胞因子、病理学积分、凋亡指数的结果

治疗组 IL-1β、IL-18、TNF-α 浓度均低于模型组，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。模型组和治疗组病理学积分均显著高于假手术组（P＜0.05），表明造模成功；治疗组病理学积分低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。治疗组凋亡指数大于模型组（P＜0.05）。见表1。

3 讨论

急性胰腺炎是外科常见急腹症，属祖国医学“腹痛”、“膈痛”、“胃脘痛”、“脾心痛”之范畴，以上腹部急性疼痛为主症。以气滞血瘀、毒瘀互结为病理特点[4]。轻型胰腺炎易于治疗，预后好；重症胰腺炎病情凶险，常伴其他脏器功能损害，预后差，病死率高。如何在急性胰腺炎早期控制其病情进展，预防急性胰腺炎向重症胰腺炎发展，减轻重症胰腺炎坏死范围等是被研究者广泛关注的问题。研究者发现，在急性胰腺炎起病初期，各类损伤因素损伤胰腺腺泡细胞。如胰腺腺泡细胞死亡以坏死方式为主，则引发炎症反应，继而触发白细胞系统何细胞因子网络的级联放大反应，损伤其他脏器，诱发多脏器功能衰竭，从而导致重症胰腺炎的发生；如胰腺腺泡细胞死亡以凋亡方式为主，则不会引起严重的炎症反应和其他脏器损害，表现为轻型胰腺炎[5]。目前，早期应用药物干预来诱导胰腺腺泡细胞凋亡是治疗急性胰腺炎新的研究热点。

表1 各组细胞因子浓度和病理学积分、凋亡指数结果比较（pg/mL，±s）

表1 各组细胞因子浓度和病理学积分、凋亡指数结果比较（pg/mL，±s）

注：与模型组比较aP＜0.05；与假手术组比较，bP＜0.01；与模型组比较，cP＜0.01；IL-1β：白介素1β；IL-18：白介素18；TNF-α：肿瘤坏死因子α

组别 例数 IL-1β IL-18 TNF-α 病理学积分（分）凋亡指数（%）假手术组模型组治疗组F值P值30 27 28 51.29±10.91 170.45 ±26.74 1，58.61±21.31a 299.01＜0.01 49.06±11.76 230.67 ±89.52 187.78±67.28a 63.82＜0.01 15.10 ±5.35 72.26±16.58 58.32 ±12.17a 175.70＜0.01 0.32±0.10 8.46±2.97b 7.24 ±1.31ab 166.08＜0.01 0.79±0.11 4.10±1.79 7.67 ±3.13c 80.73＜0.01

细胞因子是由体内免疫细胞等主动分泌的一组小分子量可溶性蛋白及多肽。细胞因子正常生理状态下表达较少。当有内、外界各种致炎因素刺激时，免疫系统被激活，免疫细胞分泌出大量细胞因子。TNF-α、IL-1β和IL-18是目前研究最充分的致炎因子，在急性胰腺炎早期，即可发现TNF-α、IL-1β和IL-18的表达增强，且与急性胰腺炎的严重程度呈正相关，可作为判断急性胰腺炎预后的根据[6]。

其中，血清TNF-α对细胞凋亡调控表现出双面性，即低浓度的TNF-α能诱导细胞凋亡，促进炎症愈合；而高浓度的TNF-α则导致胰腺腺泡细胞坏死。一方面，TNF-α通过与其受体结合诱导细胞凋亡。另一方面，TNF-α激发一系列级联放大反应，诱导炎症介质的释放，引起胰腺及胰腺外组织器官损伤甚至坏死。此外，抑制血清IL-1β和IL-18的水平可以促进胰腺腺泡细胞凋亡，减轻胰腺的炎症反应。

大承气汤由大黄、芒硝、枳实、厚朴组成，具有通里攻下、疏通气机之功效。方中大黄苦寒泻热，祛瘀通便，荡涤肠胃邪热积滞，消除致病之因为君药；然大黄苦寒，长于泻下攻积，软坚之力欠佳，燥屎难下，如同无水行舟，辅以芒硝咸寒泻热，软坚润燥通便为臣药；两者相须为用，峻下热结之力增强。然积滞内阻，致使腑气不行，佐以厚朴苦温下气，除满下胀，配以枳实苦辛破结，导滞消痞；两药行气导滞，消痞除满，助大黄、芒硝推荡积滞，攻下通便。四药相合，行气泻下并重，六腑通降，气机畅通。

从现代药理看，大黄的有效成分是蒽醌类衍生物，可促进大肠蠕动，促进排便[7]。芒硝主要成分为硫酸钠，其硫酸根离子不易被肠黏膜吸收，从而存留在肠内成为高渗性溶液，使肠内的水分增加，促进胃肠道蠕动。枳壳能促使胃肠收缩节律增加，缓解小肠痉挛[8]。厚朴的有效成分是厚朴酚，可缓解小肠平滑肌的痉挛，增强胃肠道蠕动，有利于肠功能的恢复[9]。

肠道是人体最大的细菌库[10]。急性胰腺炎时肠功能减退，肠管胀气，引起腹腔间隙综合征。肠黏膜屏障破坏[11]。肠道内细菌和毒素移位，体内免疫细胞分泌大量细胞因子，进而启动全身炎症反应，最终导致胰腺组织坏死和多脏器功能衰竭。而且由于急性胰腺炎多伴恶心、呕吐，胃内给药无法起到理想效果，所以急性胰腺炎早期的胃肠道用药途径应为经过空肠给药。

本试验通过建立急性胰腺炎大鼠模型，观察空肠内注入大承气汤对大鼠细胞因子、胰腺腺泡细胞凋亡的影响。结果显示对于急性胰腺炎大鼠模型应用大承气汤后，血清IL-1β、IL-18、TNF-α浓度水平均较模型组减低，胰腺组织病理学积分较模型组明显减低，胰腺腺泡细胞凋亡指数明显升高。提示大承气汤具有一定的抑制炎症反应的作用和促进胰腺腺泡细胞凋亡的作用，细胞因子可能是大承气汤促进胰腺细胞凋亡的中间环节。

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